蜂膠黃酮的超聲波提取工藝優化及其抗氧化活性研究

曾林暉,鄧澤元,余修亮,李紅艷

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

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蜂膠黃酮的超聲波提取工藝優化及其抗氧化活性研究

曾林暉,鄧澤元,余修亮,李紅艷*

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

在選擇超聲波頻率的基礎上,分別研究了提取時間、超聲波功率、超聲波占空比和液面高度對蜂膠總黃酮提取得率的影響。再采用響應面法,對超聲波輔助提取蜂膠黃酮的工藝進行進一步優化。并對超聲波提取的蜂膠黃酮進行抗氧化活性的研究。結果表明,20 kHz聚能超聲波對蜂膠黃酮的提取效果最好。其它因素對蜂膠總黃酮得率的影響大小順序為:超聲波占空比>液面高度>提取時間>超聲波功率;得到最佳的超聲波提取工藝參數為:提取時間18 min,超聲功率100 W,占空比75%,液面高度4 cm,蜂膠黃酮得率達到(39.06±0.48) mg/g。此方法提取出的蜂膠黃酮有較強的DPPH自由基清除能力和FRAP抗氧化能力。

超聲波,蜂膠,黃酮,響應面法,抗氧化

蜂膠是由蜜蜂(Apismellifera)采集膠源植物的幼芽、樹皮等部位分泌的樹脂,再混合蜜蜂上顎腺和蠟腺等腺體分泌物及少量花粉混合而成的,是一種具有芳香性氣味的膠狀物質[1]。蜂膠的主要成分為樹脂(55%),蜂蠟(30%),芳香揮發油(10%),花粉(5%)等。目前蜂膠中被鑒定的物質已達300余種,主要有酚酸及其酯類、黃酮類、萜烯類、芳香類、脂肪酸等[2]。蜂膠具有廣譜的抗菌活性,對大多數病原菌和病毒都有抵抗作用,并能提高人體免疫力,有“紫色黃金”和“黃酮類化合物的寶庫”的美譽[3]。同時,蜂膠還具有抗氧化、抗增殖、抗炎和降脂降糖等作用[4-5],因此被廣泛地應用于食品、藥品以及化妝品等領域[6]。蜂膠近年來成為保健食品領域研究的熱點,對蜂膠中黃酮類化合物的提取研究也具有巨大的經濟價值。

目前,常采用乙醇冷浸泡或加熱回流提取蜂膠中功能性成分,但這些方法存在耗時長、溶劑使用量大等缺點。同時,過高的提取溫度可能破壞蜂膠中功能性物質。超聲波在液體介質中能產生空化效應,有效破壞包埋結構的外層,加速內容物的溶出,從而提高提取效率。以往對超聲波提取工藝的優化,往往會忽略超聲波頻率、周期、液面高度的研究,而這些參數的變化會直接影響超聲的提取效果。本文以蜂膠為原料,采用超聲波提取蜂膠中的黃酮類物質,先對超聲波的頻率進行選擇,然后采用響應面分析法對蜂膠黃酮的提取工藝進行優化,以期獲得蜂膠黃酮的最佳提取工藝參數,并對提取的蜂膠黃酮進行抗氧化活性的研究。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蜂膠(Apismellifera)南昌同心紫巢生物工程有限公司提供;蘆丁(生化試劑,含量≥95.0%)、DPPH阿拉丁化學試劑有限公司生產;FRAP試劑盒購自碧云天生物技術有限公司;Al(NO3)3、KAc、無水乙醇均為市售分析純。

SHZ-Ⅲ型循環水式真空泵上海亞榮生化儀器廠;FA2204B電子天平上海精科天美科學儀器有限公司;超聲波細胞粉碎機(20 kHz,GA92-ⅡDA)、超聲波清洗機(28、40、68 kHz,GA-5200D)無錫上佳生物科技有限公司;722 G型可見分光光度計上海儀電科學儀器股份有限公司;ELx800 光吸收酶標儀美國伯騰儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1蜂膠預處理 蜂膠經篩選去雜后置于-18 ℃下冷凍12 h,在低溫干燥狀態下取樣,快速粉碎,過200目篩,收集粉末,密封,于-18 ℃保存備用。

1.2.2蜂膠總黃酮提取精密稱取2.5 g蜂膠粉末,加入80%乙醇溶液75 mL,按照設定的條件進行超聲波輔助提取,提取液經過抽濾后,濾液用乙醇定容于100 mL棕色容量瓶中,待測。

1.2.3總黃酮含量的測定按照GBT 24283-2006標準方法進行測定。

1.2.3.1蘆丁標準曲線的繪制精密稱取干燥至恒重的蘆丁標準品10 mg,用無水乙醇溶解并定容于50 mL容量瓶中。此溶液中蘆丁標準品濃度為0.2 mg/mL。精密吸取上述蘆丁標準品溶液0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL,分別置于25 mL容量瓶中,加95%的乙醇至體積7.5 mL,依次加10% Al(NO3)3溶液0.5 mL、9.8% KAc溶液0.5 mL,搖勻,加蒸餾水定容至刻度。靜置1 h后,以30%乙醇溶液為空白對照,用1 cm比色皿于415 nm處測定吸光度。以25 mL容量瓶中蘆丁含量為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線:y=1.182x-0.0202,R2=0.9997。

1.2.3.2黃酮得率的計算精密吸取蜂膠提取液0.5 mL于25 mL容量瓶中,按上述方法測定樣品中總黃酮含量。按照以下公式計算得率:

式中:X-由回歸方程計算出蜂膠黃酮的濃度(mg/mL);N-稀釋倍數;V-提取液體積(mL);M-稱取的蜂膠質量(g)。

1.2.4蜂膠總黃酮提取單因素實驗分別考察超聲波頻率、提取時間、功率、超聲波周期(占空比)、液面高度對提取率的影響,每次實驗重復三次。

1.2.4.1超聲波頻率和提取時間在乙醇濃度80%、料液比1∶30、功率300 W的條件下,分別考察頻率為20、28、40、68 kHz的超聲波提取率隨時間的變化,并進行無超聲波提取實驗做為對照組。其中28、40、68 kHz為發散型超聲波;20 kHz為聚能型超聲波,實驗時其占空比設定為50%(超聲2 s/間隔2 s)、液面高度為3 cm。

1.2.4.2超聲波功率在頻率20 kHz、占空比50%(聚能時間2 s)、乙醇濃度80%、料液比1∶30、提取時間20 min、液面高度3 cm的條件下,分別考察功率50、100、200、300、400 W對蜂膠黃酮提取率的影響。

1.2.4.3超聲波占空比在頻率20 kHz、聚能時間2 s、乙醇濃度80%、料液比1∶30、提取時間20 min、功率300 W、液面高度3 cm的條件下,分別考察占空比20%、33.3%、50%、66.7%、80%對蜂膠黃酮提取率的影響。

1.2.4.4液面高度液面高度是超聲探頭末端到容器底部的距離。在頻率20 kHz、占空比50%(聚能時間2 s)、乙醇濃度80%、料液比1∶30、提取時間20 min、超聲功率300 W的條件下,分別考察液面高度1、3、5、7、9 cm對蜂膠黃酮提取率的影響。

1.2.5響應面法優化工藝條件根據Box-Benhnken的中心組合實驗設計原理,基于單因素實驗結果,以提取時間(A)、超聲功率(B)、占空比(C)、液面高度(D)為響應因素,編碼水平為-1、0、1,蜂膠黃酮提取率(Y)為響應值,采用四因素三水平的響應面分析法進行實驗設計,因素水平設計見表1。

表1　響應曲面實驗因素水平設計

1.2.6抗氧化活性的研究

1.2.6.1DPPH自由基清除率的測定[7]分別檢測5、10、15、20、25、30 μg/mL總黃酮濃度的蜂膠黃酮提取液對0.2 mmol/L DPPH溶液的自由基清除率。以Trolox(5、10、15、20、25、30 μg/mL)作為陽性對照。分別確定達到同一自由基清除率時Trolox和蜂膠黃酮的濃度,濃度越低表明其清除自由基的能力越強,即其抗氧化能力越強。

準確吸取100 μL的蜂膠黃酮提取液,加入100 μL 0.2 mmol/L的DPPH溶液,37 ℃避光靜置30 min,以甲醇為空白,用酶標儀測定吸光值A517。按下列公式計算自由基清除率,以清除率為縱坐標,蜂膠黃酮濃度為橫坐標,Trolox作為陽性對照:

式中:A樣品為樣品吸光值;A空白為空白液吸光值。

1.2.6.2FRAP抗氧化能力的測定[8]分別檢測50、75、125、250、400、500 μg/mL的Trolox以及50、75、125、250、400、500 μg/mL的蜂膠黃酮提取液在593 nm處的吸光值,并繪制對照品Trolox和蜂膠黃酮的還原力曲線。當達到同一吸光值時所需的樣品濃度越小,表示還原力越強,即抗氧化能力越強。

準確吸取180 μL的FRAP工作液,加入5 μL的蜂膠黃酮提取液,37 ℃孵育3 min后,用酶標儀測定吸光值A593。以A593為縱坐標,蜂膠黃酮濃度為橫坐標作圖。Trolox為陽性對照。

1.3數據處理

所有數據均為3次重復實驗的平均值,通過運用Excel、OriginPro 9.0 數據處理軟件和Design-Expert 8.05統計軟件進行數據分析。

2　結果與分析

2.1單因素實驗結果與分析

2.1.1超聲波頻率和超聲時間由圖1可知,隨提取時間的增加,四種不同頻率超聲波的蜂膠黃酮提取率在短時間內都快速提高,而后趨于穩定,提取速率顯著高于浸泡組。發散超聲波呈現出提取率隨頻率降低而升高的趨勢,這可能是由于超聲波的頻率越低,空化作用越強,溶劑分子和物料表面的相互作用越劇烈,加快了溶劑分子擴散到物料內部的速率,從而加速黃酮類物質的溶出[9-10]。聚能超聲波比發散超聲波具有更快的提取速率和更高的提取率。發散超聲波在30 min時達到最高提取率,而聚能超聲波在15 min時就具有較好提取效果。Zhongli Pan[11]等比較了頻率為20 kHz的聚能超聲波和發散超聲波對石榴皮中抗氧化物質的影響,結果表明兩種超聲波都具有較好的提取效果,但是聚能超聲波消耗更低的能量。因此,從提取率和節約能源方面考慮,選定20 kHz的聚能超聲波進行提取,選擇15 min超聲時間為最佳提取時間。

圖1　超聲波頻率和提取時間對黃酮提取率的影響Fig.1　Effect of ultrasound frequency and extraction time on flavonoid extraction yield

2.1.2超聲波功率由圖2可知,隨超聲波功率的增加,黃酮提取率呈現先升高后降低的趨勢,在200 W時達到最大值。這可能是由于當超聲功率在0～200 W范圍內時,空化泡的形成隨功率的升高而變得更容易,并且空化泡的崩解也隨功率的升高而變得更加劇烈;當功率超過200 W后,空化泡增長的過大,以至于不能崩解或者很脆弱的崩解,大大降低了空化作用的效果,并且過多的空化泡也會阻礙超聲波的傳播[12]。此外,當超聲波的功率處于較高的水平時,其熱效應也非常顯著,使得反應體系的溫度急劇升高,將加速溶劑乙醇的揮發,降低了提取效果[13]。因此,選定超聲波功率為200 W。

圖2　超聲波功率對黃酮提取率的影響Fig.2　Effect of ultrasound power on flavonoid extraction yield

2.1.3超聲波占空比由圖3可知,隨占空比不斷提高,蜂膠黃酮提取率呈現先增高后降低的趨勢,在占空比為66.67%時達到最大值。當占空比在20%～66.67%范圍內增加時,累積超聲時間不斷增加,提取率不斷升高。當占空比高于66.67%時,由于超聲波的持續作用,熱效應開始凸顯,導致溶液溫度不斷升高,乙醇迅速揮發,因而降低了提取效果。Herrera[14]等用超聲波來提取樹莓中的酚類化合物時也發現占空比對結果具有顯著的影響。所以,選擇66.67%為最優占空比。

圖3　超聲波占空比對黃酮提取率的影響Fig.3　Effect of ultrasound duty cycle on flavonoid extraction yield

圖4　液面高度對黃酮提取率的影響Fig.4　Effect of liquid height on flavonoid extraction yield

2.1.4液面高度由圖4可見,提取率隨液面高度的增加呈現先升高后降低的趨勢,在液面高度為3 cm時達到最大值。當液面高度在1～3 cm范圍內增加時,超聲波變幅桿在溶液中的輻射面積不斷增加,空化作用不斷增強,使得提取率不斷升高;當液面高度超過3 cm時,提取率隨液面高度的升高而顯著降低,可能的原因是隨著液面高度的增加,輻射面不斷增大,超聲波慢慢的被吸收和消散,這將導致空化作用的強度降低[15]。因此,選定超聲波的最佳液面高度為3 cm。

表2　Box-Benhnken實驗設計和結果

表3　回歸模型的方差分析

2.2響應面分析

2.2.1響應面設計方案選取超聲時間(A),超聲功率(B),占空比(C),液面高度(D)四個因素作為自變量,以蜂膠黃酮提取率作為響應值。Box-Benhnken實驗設計與結果如表2所示。

2.2.2方差分析及顯著性檢驗用軟件Design-Expert.8.05對所得數據進行回歸分析,分析結果如表3所示。對各因素進行回歸擬合,得到回歸方程:

圖5　超聲提取時間(A),超聲功率(B),占空比(C),液面高度(D)對蜂膠黃酮提取率的影響Fig.5　Effect of ultrasound extraction time(A),ultrasound power(B),duty cycle(C),liquid height(D)on extraction yield of flavonoids

蜂膠黃酮提取率(mg/g)=+38.57+0.35A-0.057B+0.39C+0.38D-0.18AB+0.25AC+0.19AD-0.53BC-0.02BD+0.57CD-0.78A2-0.31B2-0.76C2-1.15D2

圖5是各因素間交互作用的響應曲面3D分析圖,等高線的形狀可反映出交互作用的強弱,等高線呈橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則表示不顯著,同時有閉合的圓或橢圓表示有最大值。

2.2.3最優工藝條件的確定與模型驗證通過Design-Expert.8.05軟件對回歸方程進行計算,得到超聲波輔助提取蜂膠黃酮最佳工藝條件,即采用頻率20 kHz的聚能超聲波,在提取時間為17.60 min,超聲功率103 W,占空比76.84%,液面高度3.84 cm的條件下,得到最高的黃酮得率為38.94 mg/g。考慮到實際條件的可操作性,將最佳工藝條件調整為:超聲提取時間18 min,超聲功率100 W,占空比75%,液面高度4 cm。為驗證結果的可靠性,采用上述優化出的工藝參數進行3次重復實驗,得到蜂膠黃酮的實際得率為(39.06±0.48)mg/g。說明所得回歸方程對蜂膠黃酮提取率進行分析和預測非常可靠,具有一定的實踐指導意義。

2.2.4蜂膠黃酮抗氧化活性測定

圖6　Trolox和蜂膠黃酮對DPPH·的清除能力Fig.6　DPPH· radical scavenging activity of Trolox and propolis flavonoids

2.2.4.1DPPH·清除能力測定由圖6可知,一定濃度范圍內,DPPH·的清除率隨蜂膠黃酮和Trolox濃度的增加而增大,呈現一定的量效依賴關系。在相同濃度下,Trolox比蜂膠黃酮的清除率要強。當清除率達到60%時,所需的Trolox和蜂膠黃酮的濃度分別為18和21 μg/mL。由此可知,蜂膠黃酮具備一定的DPPH·清除能力,但稍弱于Trolox。

2.2.4.2FRAP抗氧化能力測定由圖7可知,一定濃度范圍內,Trolox和蜂膠黃酮的總抗氧化能力隨濃度的增加而增大,呈現一定的量效依賴關系。在相同濃度下,Trolox比蜂膠黃酮的清除率要強。當吸光值達到0.6時,所需的Trolox和蜂膠黃酮的濃度分別為250和330 μg/mL,可見蜂膠黃酮具有較強的FRAP抗氧化能力,但弱于Trolox。

圖7　Trolox和蜂膠黃酮總抗氧化能力測定Fig.7　Total antioxidant activity of Trolox and propolis flavonoids

3　結論

本實驗對超聲波輔助提取蜂膠黃酮過程中的不同工藝參數進行了優化。選定了合適的超聲波頻率,通過響應曲面法建立了超聲波輔助提取蜂膠黃酮的二次多項式數學模型,得到了超聲波提取蜂膠黃酮的最佳工藝,并進行蜂膠黃酮抗氧化活性的研究。實驗結果表明,超聲提取時間、超聲波功率、超聲波占空比和液面高度對蜂膠黃酮提取率影響的大小關系是:占空比>液面高度>超聲提取時間>超聲功率。優化出的超聲波輔助提取蜂膠黃酮的最佳工藝條件為:超聲波頻率為20 kHz,超聲提取時間18 min,超聲功率100 W,占空比75%,液面高度4 cm,此條件下蜂膠黃酮的實際得率為(39.06±0.48)mg/g。超聲波提取得到的蜂膠黃酮具有較強的DPPH自由基清除能力和FRAP抗氧化能力,是一種天然的抗氧化資源。

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權威·核心·領先·實用·全面

Optimization of the ultrasound-assisted extraction of flavonoids from propolis and its antioxidant activity

ZENG Lin-hui,DENG Ze-yuan,YU Xiu-liang,LI Hong-yan*

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

The flavonoids of propolis were extracted by ultrasound assisted method,the extracted conditions were optimized by response surface methodology,and the antioxidant activities of flavonoids extracted by pulsed ultrasound were analyzed by DPPH and FRAP assay. First,the optimal frequency of ultrasound was selected. On the basis of single variable experiment,the extracted conditions of flavonoids in propolis were optimized by 4-variable,3-level Box-Behnken experimental design. The optimized ultrasound frequency was 20 kHz,the order of other factors affecting the total flavonoid content was the duty cycle>liquid height>extraction time>the power of ultrasound. The optimized parameters were as follows:extraction time 18 min,the power of ultrasound 100 W,duty cycle 75% and liquid height 4 cm. The extraction yield of flavonoids were(39.06±0.48)mg/g. At these conditions,the flavonoids extracted by pulsed ultrasound assisted method showed great DPPH and FRAP antioxidant activities.

ultrasound;propolis;flavonoids;response surface methodology;antioxidant activity

2015-11-24

曾林暉(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：食品科學與工程，E-mail:linhuizeng1990@aliyun.com。

李紅艷(1986-)，女，博士，副教授，研究方向：抗氧化、食品營養、食品化學，E-mail:lihongyan@ncu.edu.cn。

南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室青年研究基金項目資助(SKLF-QN-201506)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)12-0295-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.047