姜黃素與茶多酚聯用固體脂質納米粒的制備及抗腫瘤活性研究

賈　坤,李　銳,*,張　全

(1.西華大學食品與生物工程學院,四川成都 610039;2.四川大學華西藥學院,四川成都 610041)

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姜黃素與茶多酚聯用固體脂質納米粒的制備及抗腫瘤活性研究

賈坤1,李銳1,*,張全2

(1.西華大學食品與生物工程學院,四川成都 610039;2.四川大學華西藥學院,四川成都 610041)

采用薄膜-超聲法制備姜黃素與茶多酚聯用的固體脂質納米粒,采用HPLC-DAD法建立了納米粒中姜黃素和茶多酚類共5個活性成分的同步含量測定方法,考察了聯用固體脂質納米粒在不同儲存條件下的穩定性,并對其抗腫瘤活性進行了研究。結果表明:當配方為姜黃素與茶多酚聯用混合物(含量比例1∶1)40 mg,硬脂酸120 mg,卵磷脂60 mg,吐溫-80(1.0%)10 mL時,所得固體脂質納米粒平均粒徑為93.8 nm,多分散度(polydispersity index,PDI)0.172,Zeta電位為-44.5 mV,平均包埋率達到93.08%,載藥量為12.81%;姜黃素和茶多酚類5個活性成分在4 ℃條件下儲存穩定性良好;MTT法實驗結果表明聯用固體脂質納米粒對HepG2和A549腫瘤細胞較姜黃素、茶多酚單獨給藥有更強的腫瘤細胞抑制作用(p<0.05)。結果證明,姜黃素與茶多酚聯用制備固體脂質納米粒的工藝合理可行,包埋率高,粒度均勻,穩定性好,對腫瘤細胞具有明顯的協同抑制作用。姜黃素與茶多酚兩種天然酚類活性成分的聯用在食品工業領域具有極大的潛力。

姜黃素,茶多酚,固體脂質納米粒,穩定性,抗腫瘤

茶多酚(tea polyphenols,TP)是茶葉中多酚類物質的總稱,是綠茶中最主要的生物活性成分[1]。茶多酚是一種天然的抗氧化劑,具有抗氧化和抗腫瘤等生理活性[2-4],同時也是一種天然功能性食品添加劑,在食品工業領域廣泛應用[5-7]。茶多酚主要由兒茶素類成分組成,包括表兒茶素(epicatechin,EC)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin,EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate,ECG)以及表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)[8]。其中EGCG是活性最強的兒茶素類成分,它的抗氧化活性是維生素E的20倍,是過氧化氫酶(SOD)的6倍,且對腫瘤細胞具有極強的抑制活性[9]。姜黃素(curcumin,CUR)是從姜科植物姜黃(CurcumalongaL.)根莖中提取的天然酚類色素成分[10]。研究表明,姜黃素具有顯著的抗氧化、抗腫瘤和抗炎癥等作用,由于姜黃素的抗腫瘤效果顯著且無毒副作用,已被美國國立衛生研究院列為第三代抗腫瘤化學預防藥[11-14]。

姜黃素和茶多酚在理化性質及生理活性方面具有以下幾點共性:兩者均是源自植物提取物的天然酚類成分,在化學結構上具有相似性;兩者均屬于可食用的天然色素類成分,可應用于食品工業領域;兩者都具有極強的抗氧化作用,生理活性表現為顯著的抑制腫瘤細胞增殖的作用。有文獻報道姜黃素類化合物與茶多酚聯用成功抑制了肺癌細胞和結腸癌細胞的增殖[15-16],顯示兩種天然植物酚類化合物的聯用在腫瘤治療方面有潛在的協同作用優勢。兩者在體內的吸收極差,口服后都呈現較低的生物利用度,極大限制了姜黃素與茶多酚在功能性食品、醫藥領域的廣泛應用。

固體脂質納米粒(solid lipid nanoparticles,SLN)作為藥物載體,可以有效地提高被包裹藥物的體內生物利用度,且對人體有很好的生物相容性,同時具有控制藥物釋放、避免藥物氧化和降解、增加藥物通過細胞膜的能力,以及良好的靶向性等優點,是一種針對低生物利用度活性成分的理想給藥系統[17]。制備固體脂質納米粒的方法主要包括:薄膜超聲法、逆向蒸發法、注入法、冷凍干燥法等[18-19]。薄膜超聲法適合包裹小分子生物活性成份如多酚類、黃酮類、蒽醌類、倍半萜類等。

目前,關于酚類活性成分制備脂質體的研究有石榴皮多酚脂質體[20]、茶多酚脂質體[21]、姜黃素脂質體[19]等報道,但未曾見將兩種酚類活性物質聯用制備固體脂質納米粒的研究,加之已有文獻報道姜黃素類化合物與茶多酚聯用在腫瘤治療方面有潛在的協同作用[15-16]。因此,本課題研究姜黃素與茶多酚聯用制備固體脂質納米粒(CUR-TP-SLNs),并評估其對腫瘤細胞活性的抑制作用具有重要的現實意義,不但能夠改善兩者自身的低生物利用度特性、更好的實現協同效應,也能夠極大擴展姜黃素與茶多酚聯用后在功能性食品、醫藥等領域的廣泛應用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

姜黃素、表兒茶素、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯以及表沒食子兒茶素沒食子酸酯對照品(純度99.8%)中國食品藥品檢定研究院;硬脂酸、卵磷脂、乙腈、甲酸美國Sigma公司;吐溫-80美國Amresco公司;葡聚糖凝膠Sephadex-G50美國GE公司;甲醇、二氯甲烷均為國產分析純。

Waters高效液相色譜儀美國Waters公司;旋轉蒸發儀上海亞榮生化儀器廠;KQ-250DB數控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;電子分析天平德國Satorius公司;Zetasizer 1000HSA激光電位粒徑分析儀英國Malvern公司。

1.2實驗方法

1.2.1CUR-TP-SLNs的制備方法采用薄膜超聲法制備姜黃素與茶多酚的聯用固體脂質納米粒。參考文獻中姜黃素與茶多酚聯用的比例選擇[15-16],按1∶1等量精密稱取CUR和TP,將兩者混合后溶于丙酮中,超聲(240 W)處理30 min。稱取適量的硬脂酸和卵磷脂溶于二氯甲烷中,與前者充分混合后置于40 ℃恒溫水浴中旋轉蒸發除去有機溶劑,使成膜材料在瓶壁形成均勻的薄膜,再加入適量的吐溫-80(1.0%),超聲(240 W)處理40 min,即得固體脂質納米粒的均勻混懸體系。

1.2.2CUR-TP-SLNs的制備工藝優化

1.2.2.1正交實驗根據單因素預實驗結果,選擇姜黃素與茶多酚質量比1∶1,超聲功率240 W,以姜黃素與茶多酚混合物、硬脂酸、卵磷脂及吐溫-80(1.0%)用量為考察因素,以包埋率和載藥量為評價指標,綜合評分根據制劑性質需求確定包埋率與載藥量的權重分別為0.6和1.2,按下列公式計算:綜合評分=(包埋率×0.6+載藥量×1.2)×100。各因素及水平如表1。

表1　正交設計L9(34)因素水平表

1.2.2.2優化處方的驗證考察按照優化處方的配比制備三批次CUR-TP-SLNs,測定平均包埋率及載藥量,用粒徑電位分析儀測定粒徑、PDI以及Zeta電位。

1.2.3CUR-TP-SLNs物化性質的評價

1.2.3.1CUR-TP-SLNs的含量測定方法色譜柱:YMC-Pack-ODS-A C18reversed column(250 mm×4.6 mm id,5 μm)及Agilent Zorbax SB-C18保護柱(12.5 mm×4.6 mm id,5 μm);流動相:乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B);洗脫程序:0～36 min:1%～16% B;36～40 min:16%～35% B;40～60 min:35%～70% B;柱溫:33 ℃;流速:1.0 mL/min,進樣體積:15 μL;280 nm波長下檢測EC、EGC、ECG和EGCG含量,425 nm波長下檢測CUR含量。

分別精密稱取CUR、EC、EGC、ECG和EGCG標準品適量,置于5 mL容量瓶中,甲醇溶解并定容,得到濃度依次為587.19、189.60、619.91、506.43、580.71 μg/mL的五個單體化合物的對照品儲備液,保存備用。采用外標法,將儲備液分別進行2倍梯度稀釋,每個單體化合物分別得到8個不同濃度的對照品溶液,依次進樣15 μL,記錄色譜圖和峰面積,以濃度對峰面積做一元回歸,得到回歸方程。

1.2.3.2包埋率和載藥量的測定方法[19]分別精密吸取0.1 mL CUR-TP-SLNs混懸體系上葡聚糖凝膠G50柱,用10 mL蒸餾水洗脫于25 mL容量瓶中,加甲醇定容,得到樣品1。另取0.1 mL樣品直接加甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中,即得樣品2。分別進樣15 μL,記錄色譜圖與峰面積,HPLC外標法計算樣品1和樣品2中CUR、EC、EGC、ECG和EGCG的總含量,分別記為M1和M2。按下式計算包埋率和載藥量:

包埋率(%)=M1/M2×100

載藥量(%)=M1/(M1+M硬脂酸+M卵磷脂)×100

式中:M1、M2分別為樣品1和樣品2中CUR、EC、EGC、ECG和EGCG的總含量;M硬脂酸、M卵磷脂分別為相應的硬脂酸和卵磷脂的含量。

1.2.3.3形態觀察采用負染法。取1滴CUR-TP-SLNs滴于放在濾紙上的銅網上,晾干后置于蠟板上,用1%的磷鎢酸染色3～5 min,用濾紙小片吸干銅網邊緣多余染液,晾干,用透射電子顯微鏡觀察并拍照,觀察其粒徑大小和形態。

1.2.3.4粒徑、電位測定用激光電位粒徑分析儀測定CUR-TP-SLNs的粒徑、粒徑分布以及電位。

1.2.4穩定性考察固體脂質納米粒屬于納米分散體系,在存放過程中會發生理化性質改變從而影響穩定性能。本實驗分別在4 ℃和常溫條件下將CUR-TP-SLNs混懸體系放置0、10、20、30和40 d,按1.2.3項方法測定計算包埋率,測包埋率的變化。

1.2.5MTT細胞毒活性法采用MTT法測定CUR-TP-SLNs對HepG2細胞和A549細胞增殖的抑制效應。在DEME低糖培養基(10%胎牛血清)中培養腫瘤細胞,收集對數期細胞,按5×104個/mL接種于96孔板。將不同濃度的固體脂質納米粒混懸液準確加入到細胞培養基中,37 ℃、5% CO2和飽和濕度的培養箱中培養48 h。于每孔加入20 μL的MTT溶液繼續培養4 h,再向每孔中加入150 μL DMSO溶解結晶物,搖床振蕩10 min后于全自動酶聯免疫檢測儀測定各孔在490 nm波長的OD值。按下列公式計算細胞存活率:細胞存活率(%)=OD加藥組/OD對照組×100。分別設計對照組(空白脂質體)和空白組。所有實驗結果均測量三次取平均值。

1.2.6數據處理采用DPS7.05數據處理軟件處理數據。

2　結果與分析

2.1CUR-TP-SLNs姜黃素和茶多酚類成分的含量測定

外標法得到的回歸方程如表2所示,CUR-TP-SLNs樣品及混標色譜圖如圖1所示。

表2　CUR、EC、EGC、ECG和EGCG回歸方程(n=3)

圖1　CUR-TP-SLNs樣品、混標樣品的HPLC-DAD高效液相色譜圖Fig.1　HPLC-DAD chromatograms of CUR-TP-SLNs and mixed standards

2.2處方優化

本實驗設計將CUR與TP聯用制備固體脂質納米粒,通過正交實驗篩選出最佳工藝。正交實驗表及結果見表3,方差分析結果見表4。

由表3正交實驗的極差值可以推斷出,各因素對實驗指標影響的主次順序是A、B、D、C,即CUR+TP的總用量、硬脂酸用量、吐溫-80用量、卵磷脂用量的影響依次減弱,結合表4方差分析結果可以得出最佳制備工藝為:姜黃素與茶多酚聯用總用量40 mg,硬脂酸120 mg,卵磷脂60 mg,吐溫-80(1%)10 mL。

表5　驗證實驗(n=3)

表3　正交實驗結果

表4　方差分析

注:F0.05(2,2)=19。

2.3優化處方的驗證考察

按照優化處方的配比制備三批次CUR-TP-SLNs,測定的平均包埋率、藥量粒徑、PDI以及Zeta電位如表5所示,綜合評分71.22,高于正交實驗組的最高評分。

驗證實驗結果表明,依據正交實驗所得到的最佳條件制備的三批次樣品中姜黃素(CUR)、表兒茶素(epicatechin,EC)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin,EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate,ECG)以及表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)的平均包埋率為93.08%,載藥量為12.81%,實驗測得的納米粒的平均粒徑為93.8 nm,PDI為0.172,表面粒徑分布均勻;Zeta電位為-44.5 mV,表明脂質體表面帶負電荷,且體系較為穩定,制備工藝穩定可行,重現性好。

2.4CUR-TP-SLNs的性狀觀察

透射電子顯微鏡(TEM)下觀測結果(圖2)納米粒輪廓清晰,呈球性或橢球形,表明優化后的工藝制備出的固體脂質納米粒完整、分布均勻,工藝可行,達到了預期效果。

圖2　固體脂質納米粒的TEM圖像(50000×)Fig.2　Transmission electron microscopic image of the solid lipid nanoparticles(50000×)

2.5CUR-TP-SLNs的穩定性

CUR-TP-SLNs貯藏穩定性如圖3所示。由圖3可知,CUR-TP-SLNs在4 ℃條件下儲存穩定性良好,姜黃素與茶多酚各成分的包埋率呈現緩慢下降趨勢,在40 d的考察時間內5個成分的平均包埋率由93.08%下降為72.45%,下降20.63%,觀察脂質體溶液無絮凝與沉淀現象。常溫下存放的CUR-TP-SLNs發現5個成分的平均包埋率均有大幅度下降,第40 d檢測發現被包埋成分已完全滲漏,且出現大量沉淀。研究結果表明姜黃素與茶多酚聯用固體脂質納米粒(CUR-TP-SLNs)在4 ℃低溫條件下儲存,性質基本穩定。

圖3　CUR-TP-SLNs的穩定性曲線Fig. 3　The leakage rate curve of CUR-TP-SLNs

2.6CUR-TP-SLNs的抗腫瘤活性研究

為研究CUR與TP聯用后的抗腫瘤活性效果,實驗設立CUR-SLNs和TP-SLNs組作為對照,制備方法同1.2.1。結果顯示CUR-SLNs、TP-SLNs、CUR-TP-SLNs均對HepG2和A549細胞增殖有抑制作用,結果見圖4。其中CUR與TP聯用對腫瘤細胞抑制作用較CUR、TP單獨制備SLNs有更好的抑制效果(p<0.05),CUR-TP-SLNs聯用制劑在質量濃度為20 μg/mL時,HepG2細胞的存活率為44.2%,A549細胞存活率為40.5%;當聯用制劑質量濃度為40 μg/mL時,HepG2細胞存活率不超過28.8%,A549細胞存活率不超過24.6%,CUR與TP聯用固體脂質納米粒制劑對兩種腫瘤細胞均產生較好的抑制作用。

3　結論

本實驗采取薄膜超聲法成功制備姜黃素與茶多酚聯用固體脂質納米粒,正交實驗篩選出最佳制備工藝為:姜黃素與茶多酚(按1∶1比例組成)聯用總量40 mg,硬脂酸120 mg,卵磷脂60 mg,吐溫-80(1%)用量10 mL,所得CUR-TP-SLNs平均粒徑為93.8 nm,PDI為0.172,Zeta電位為-44.5 mV,平均包埋率達到93.08%,載藥量為12.81%;姜黃素和茶多酚類5個活性成分在4 ℃條件下儲存穩定性良好。CUR-TP聯用制劑對HepG2和A549腫瘤細胞的抑制作用較CUR、TP單獨使用有更好的抗腫瘤活性,初步證明了兩者以固體脂質納米粒的形式聯用給藥能夠產生協同作用,增強對腫瘤細胞增殖的抑制作用和對細胞膜的滲透效果。

本項目的研究結果表明兩種天然植物酚類活性成分—姜黃素和茶多酚聯用制備固體脂質納米粒在功能性食品、醫藥等領域有良好的應用前景。

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Preparation of solid lipid nanoparticles formulation by combination of curcumin with tea polyphenols and the study of anti-tumor activity

JIA Kun1,LI Rui1,*,ZHANG Quan2

(1.School of Food and Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China;2.West China School of Pharmacy,Sichuan University,Chengdu 610041,China)

Solid lipid nanoparticles formulation was prepared by the combination of curcumin with tea polyphenols through film-ultrasonic wave dissolving techniques,a method for determining the five active content from curcumin and tea polyphenols in nanoparticles by HPLC-DAD was established,the stability of CUR-TP-SLNs under different storage conditions and evaluate the anti-tumor activity were studied. The results showed that the optimum formula was selected as curcumin and tea polyphenols(40 mg),stearic acid(120 mg),lecithin(60 mg)and tween -80(1.0%,10 mL),the mean particle size diameter and polydispersity index(PDI)were 93.8 nm and 0.172,zeta potential was-44.5 mV,the average entrapment efficiency and the ratio of loading drag approached 93.08% and 12.81%,respectively. The CUR-TP-SLNs formulation was stable under 4 ℃ storage.MTT assay showed that compared with curcumin and tea polyphenols,combined nanoparticles exhibited stronger inhibitory effect to HepG2 and A549 cells(p<0.05). To conclusion,the preparation technique of CUR-TP-SLNs was feasible and applicable with high entrapment efficiency,unique size and good stability,the curcumin and tea polyphenols clearly exhibit synergism effect against tumor cells activity. The combination of two phenolic components such as curcumin and tea polyphenols may have great potential in food industry.

curcumin;tea polyphenols;solid lipid nanoparticles;stability;antitumor

2015-12-25

賈坤(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：活性天然產物的化學分析與體內過程，E-mail：jiakun0818@163.com。

李銳(1981-)，男，博士，副教授，研究方向：活性天然產物的化學分析、質量控制與產業化開發，E-mail：lirui-elite@163.com。

國家自然科學基金(81302742)；教育部春暉計劃項目(13205638)；四川省教育廳重點項目(11ZA005)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)12-0237-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.037