野生酵母和商品酵母發酵葡萄酒中揮發性成分差異研究

劉峻溪,姜凱凱,韓愛芹,李蕊蕊,趙新節,孫玉霞,王世平

(1.齊魯工業大學山東省微生物工程重點實驗室,山東濟南 250353;2.山東省農業科學院農產品研究所,山東省農產品精深加工技術重點實驗室,山東濟南 250100)

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野生酵母和商品酵母發酵葡萄酒中揮發性成分差異研究

劉峻溪1,2,姜凱凱1,2,韓愛芹1,李蕊蕊1,2,趙新節1,孫玉霞2,*,王世平2

(1.齊魯工業大學山東省微生物工程重點實驗室,山東濟南 250353;2.山東省農業科學院農產品研究所,山東省農產品精深加工技術重點實驗室,山東濟南 250100)

采用頂空固相微萃取(HS-SPME)和氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)技術對5株商品釀酒酵母和7株野生釀酒酵母所釀葡萄酒中的揮發性物質進行分析。結果表明,各葡萄酒中揮發性物質的組成成分相差不大,但在含量上存在差異,野生釀酒酵母所釀造的葡萄酒中主要揮發性物質的總含量要高于商品釀酒酵母。對于葡萄酒中主要由酵母代謝產生的3類揮發性物質—酯類、醇類和酸類,其含量最高的均為用野生釀酒酵母釀造的葡萄酒,其中以W2和W7最為突出。感官分析結果表明,C1、C2和W2的果香、花香較為突出,C4和W2具有明顯的草本味,C2和W1的胡椒味較強。

釀酒酵母,葡萄酒,揮發性物質,HS-SPME,GC-MS

Agro-Products Processing Technology of Shandong,Ji’nan 250100,China)

葡萄酒中的揮發性物質是葡萄酒獨特風味的形成基礎,主要包括醇類、酯類、酸類和揮發性酚類物質等。這些物質的形成與許多因素有關,包括葡萄品種、釀造工藝、酵母和陳釀等[1]。在這些因素中,酵母的作用最為關鍵,酵母在將糖轉化為酒精的同時,生成的代謝產物可以直接或者間接地參與到揮發性物質的合成中[2]。與酒精發酵有關的酵母種屬很多,其中最主要也最重要的是釀酒酵母。釀酒酵母參與了發酵的整個過程,直到發酵結束,而非釀酒酵母只在發酵的前兩天存在活力[3]。因此,釀酒酵母影響著葡萄酒的風味,決定著葡萄酒的品質[4]。

目前,我國葡萄酒面臨的一個重大問題就是同質化嚴重,其原因之一是由于過多的依賴進口商品活性干酵母,導致各產區產地所釀葡萄酒缺乏地域特色。因此,選擇適合本土葡萄的野生釀酒酵母成為近幾年研究的熱點,許多學者針對我國各主要產區進行了相應的野生釀酒酵母篩選研究[5-7]。但這些研究都主要側重于野生酵母的耐受性,而對于野生釀酒酵母的釀酒特性和對葡萄酒香氣影響的研究很少。山東煙臺產區受海洋氣候的影響,有著優越的地理環境和氣候條件,是我國葡萄酒釀造歷史最為悠久的區域。本研究以煙臺赤霞珠葡萄為原料,分別接種商品活性干酵母和野生釀酒酵母釀造紅葡萄酒,對各菌株的耐受性以及各葡萄酒的揮發性物質進行分析比較,以期獲得合適的野生釀酒酵母,并為野生釀酒酵母的實際應用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

野生酵母本實驗室從成熟赤霞珠葡萄表面分離純化的7株野生釀酒酵母,編號為W1～W7;商品酵母購于上海杰兔工貿有限公司的5株商品活性干酵母BDX、BM4×4、D254、L2323和RC212,編號為C1～C5;葡萄山東煙臺萊山成熟赤霞珠葡萄,2014年10月采收,總糖含量:239.39 g/L,可滴定酸含量:4.10 g/L;YPD培養基1%酵母浸粉,2%葡萄糖,2%蛋白胨,115 ℃滅菌30 min;乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、異丁醇、異戊醇、己醇、2-苯乙醇、2,3-丁二醇、乙酸、3-甲基丁酸、己酸、辛酸美國Sigma公司;4-甲基-2-戊醇色譜純(98%),美國Aldrich公司。

SW-CJ-1FD型超凈工作臺蘇州安泰空氣技術有限公司;LDZM-80KCS型立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫療器械廠;SPL-250型生化培養箱天津萊玻特瑞儀器設備有限公司;ZHWY-200H型恒溫振蕩培養箱上海智城分析儀器制造有限公司;C-MAG HS7 digital型恒溫加熱磁力攪拌器德國IKA公司;SPME手動進樣手柄、DVB/CAR/PDMS萃取頭(50/30 μm)美國Supelco公司;GC-7890B/MS-5977A氣相色譜-質譜聯用儀、VF-WAXms(30 m×0.32 mm×0.25 μm)色譜柱美國Agilent公司。

1.2實驗方法

1.2.1酵母發酵力實驗將YPD培養基和杜氏發酵管放于試管中,滅菌后接入各酵母,28 ℃條件下靜止培養,觀察杜氏發酵管中氣泡的形成情況,記錄氣泡開始形成和充滿整個杜氏發酵管所用的時間。各酵母菌株均進行三次平行實驗。

1.2.2酵母酒精耐受性實驗將YPD培養基和杜氏發酵管放于試管中,滅菌后添加無水乙醇,使其含量達到12%。接入各酵母,28 ℃下靜止培養1周,觀察杜氏發酵管中氣泡的形成情況。將能夠產生氣泡的酵母菌株再依次接入乙醇含量為14%、16%、18%和20%的YPD培養基中,觀察杜氏發酵管中氣泡的形成情況。各酵母菌株均進行三次平行實驗。

1.2.3酵母SO2耐受性實驗將YPD培養基和杜氏發酵管放于試管中,滅菌后添加亞硫酸,使其總SO2的含量為400 mg/L,接入各酵母,28 ℃下靜止培養1周,觀察杜氏發酵管中氣泡的形成情況。將能夠產生氣泡的酵母菌株再依次接入總SO2含量為500、600、700 mg/L的YPD培養基中,觀察杜氏發酵管中氣泡的形成情況。各酵母菌株均進行三次平行實驗。

1.2.4紅葡萄酒釀造實驗將7株野生酵母和5株商品酵母分別接種于盛有50 mL YPD培養基的三角瓶中,于25 ℃,150 r/min條件下培養12 h。培養結束后,各取1 mL分別轉接到盛有50 mL澄清葡萄汁(已滅菌)的250 mL三角瓶中,25 ℃,150 r/min條件下培養12 h。

赤霞珠葡萄除梗后果粒混合均勻,分別稱取4.5 kg置于12個5 L的廣口瓶中,手工破碎。添加SO2至濃度為60 mg/L,浸漬12 h后接入酵母,恒溫條件下(25 ℃)進行酒精發酵。發酵結束后取自流汁,調整葡萄酒中SO2的濃度至40 mg/L,以抑制其蘋果酸-乳酸發酵(避免葡萄酒香氣在蘋果酸-乳酸發酵后發生變化),酒樣裝瓶避光貯存待測。

1.2.5揮發性物質的提取準確量取6 mL葡萄酒酒樣于15 mL頂空瓶中,加入1.5 g NaCl促進揮發性物質的揮發,再加入30 μL內標4-甲基-2-戊醇以及磁力轉子,立即用帶有聚四氟乙烯(PTFE)墊片的蓋子蓋緊。加熱溫度為40 ℃,轉速為100 r/min,預熱10 min。然后用固相微萃取頭在40 ℃加熱條件下萃取吸附50 min。待吸附平衡后進行氣相色譜-質譜分析。各葡萄酒酒樣均進行三次平行實驗。

1.2.6氣相色譜-質譜條件程序升溫為:35 ℃保持1 min,以3 ℃/min的速度升至160 ℃,以5 ℃/min的速度升至200 ℃,以10 ℃/min的速度升至220 ℃,保持5 min。載氣:He(純度99.999%),流速1.0 mL/min。檢測器溫度280 ℃,前進樣口溫度280 ℃,采用不分流進樣。

采用EI電子轟擊式離子源;電子能量為70 eV,分辨率500;離子源溫度為230 ℃;全掃描模式,掃描范圍:30～500 amu。

1.2.7揮發性物質的定性定量分析

1.2.7.1定性分析采用氣相色譜-質譜-計算機聯用儀進行分析鑒定。對于已有標樣的揮發性物質,根據已建立的相同色譜條件下該物質的保留指數和質譜信息進行定性;對于沒有標樣的揮發性物質,根據計算機譜庫NIST11對比結果進行半定性。

1.2.7.2定量分析用色譜級乙醇配制12%(v/v)的乙醇水溶液,酒石酸調pH至3.6,模擬葡萄酒溶液。按照葡萄酒中揮發性物質的濃度水平,分別稱取各標樣用乙醇溶解,混合配制標準母液,連續梯度稀釋5個不同濃度,建立主要揮發性物質標準曲線。對于已有標樣的揮發性物質,利用已建立的相應標準曲線定量;對于沒有標樣的揮發性物質,采用半定量法定量。

1.2.8酒樣感官分析各葡萄酒樣放在通風良好、無任何氣味和噪音的房間中,由專業人員采用定量分析描述法對各酒樣進行感官分析[8]。感官評定人員先各自對樣品進行品評,記錄能反映酒樣感官特征的描述性詞匯。由品評組長匯總全部詞匯,再經小組討論,確定最終的描述性詞匯為:果香、花香、胡椒、草本、香草、酵母味和脂肪味。

品評采用的標度為一條長10 cm的直線,品評人員在直線上標出能代表某種感官特征強度的標志,從左向右強度逐漸增加。品評結束后,用直尺把各強度轉化為數值,輸入計算機進行統計分析。

1.3數據處理

各酒樣的測定均重復3次,應用Excel和SPSS數據分析軟件對數據進行統計分析。

2　結果與討論

2.1酵母的發酵力

酵母的發酵力是指酵母啟動發酵和到達發酵高峰所用的時間,所用時間越短說明酵母的發酵力越強,發酵周期也會相應縮短,這有利于提高葡萄酒生產的經濟效益。表1表明,釀酒酵母一般在接種后的6.0～8.0 h啟動發酵,在11.0～12.0 h達到發酵的高峰,其中C2、C5和W7的發酵力強于其他酵母。

表1　酵母發酵力實驗結果

2.2酵母的酒精耐受性

在發酵過程中,酵母將糖轉化為酒精,但當酒精達到一定濃度時,又會對酵母本身產生抑制作用,主要表現在抑制酵母的生長、存活和發酵力3個方面[9]。釀酒酵母對高濃度酒精的耐受性是葡萄酒生產中的重要特性,釀酒酵母對高濃度酒精的強耐受性可以提高設備利用率和生產效率。各釀酒酵母對不同濃度酒精的耐受性實驗結果見表2，結果表明,商品酵母和野生酵母都能耐受12%酒精,野生酵母在14%酒精中的生長情況普遍強于商品酵母,但當酒精濃度進一步提高時,大多數野生酵母的耐受性弱于商品酵母,野生酵母W6的酒精耐受性較為突出。

表2　酵母的酒精耐受性實驗結果

注:“-”表明杜氏管中沒有氣泡,“+”表明杜氏管中氣泡較小,“++”表明杜氏管中氣泡占到一半,“+++”表明杜氏管中氣泡超過一半,“++++”表明杜氏管中充滿氣泡;表3同。

2.3酵母的SO2耐受性

在葡萄酒釀造過程中,需要多次添加SO2,酒中總SO2濃度一般不超過250 mg/L,其主要目的是對發酵微生物的選擇作用、抗氧化作用和澄清作用等[10]。SO2在發揮作用的同時也會對酵母產生抑制作用,因此釀酒酵母對高濃度SO2的耐受性也是葡萄酒生產中的重要參數,是葡萄酒品質的保證。各釀酒酵母對不同濃度SO2的耐受性實驗結果見表3,表明商品酵母和野生酵母的SO2耐受性均滿足釀造要求,且都能耐受400 mg/L的濃度,但隨著SO2濃度的逐步提高,商品酵母對SO2的耐受性明顯強于野生酵母。這可能與商品酵母的馴化有關。

表3　酵母的SO2耐受性實驗結果

2.4各酵母所釀葡萄酒的基本理化指標

表4　不同酵母所釀葡萄酒基本理化指標

注:同列標有不同小寫字母表示差異達到顯著水平(p<0.05)。

用各釀酒酵母進行葡萄酒釀造實驗,發酵結束后葡萄酒的pH、總酸、殘糖和酒精度測定結果見表4。各酒樣的pH均在3.7左右,W7最低為3.59。W7酒樣的總酸最高(8.27 g/L),其次是W6(7.85 g/L),其他酒樣的總酸均低于7.50 g/L,C3最低為6.41 g/L。各酒樣的殘糖均低于4 g/L,其中W1的殘糖最低(2.56 g/L)。各酒樣的酒精度相差不大,C5酒精度最高(12.88%),W1酒精度最低(12.36%)。

表5　各葡萄酒中揮發性物質的相對含量

續表

注:nd:未檢出。

2.5各葡萄酒中的揮發性物質

采用HS-SPME和GC-MS聯用方法對各葡萄酒中的揮發性物質進行提取并檢測,結果見表5,其中,相對含量是指該酒樣中某揮發性物質含量占總揮發性物質含量的比例。共檢測出了58種揮發性物質,酯類26種、醇類19種、酸類6種以及其他類7種,葡萄酒中比較常見的揮發性物質在各酒樣中均能檢測到。檢測到揮發性物質最多和最少的葡萄酒都是由野生酵母釀造,W7最多52種,W3最少37種。

各酒樣均能檢測到的揮發性物質共有35種,結合文獻報道[11-12],其中15種為與酵母代謝密切相關的揮發性物質,它們的總峰面積均占各葡萄酒中揮發性物質總峰面積的86.40%以上,因此把這15種物質作為葡萄酒中主要揮發性成分進行研究。對這15種主要揮發性物質進行定量計算,計算結果見表6,表7。

表6　各商品酵母葡萄酒主要揮發性物質含量(mg/L,n=3)

表7　各野生酵母葡萄酒主要揮發性物質含量(mg/L,n=3)

在商品酵母所釀造的紅葡萄酒中,主要揮發性物質總量最高的是C1(305.62 mg/L),最低的是C3(217.64 mg/L);而野生酵母中,主要揮發性物質總量最高的是W2(326.84 mg/L),最低的是W1(267.68 mg/L)。

2.5.1酯類物質在檢測出來的揮發性物質中,酯類物質的種類最多。酯類主要是在酵母代謝過程中形成的,能夠賦予葡萄酒以新鮮的水果香氣,是葡萄酒中果香的主要來源[13]。酯類的感覺閾值很低,易于被感知,另外,酯類物質之間會相互影響,形成協同作用[14]。酯類物質含量在不同酵母之間存在顯著性差異(p<0.05),最高的是W2(19.09 mg/L),其次是W7(18.93 mg/L),含量最低的是W5(10.87 mg/L)。不計W5,除W4略低于C3外,其他野生酵母釀造的葡萄酒的酯類含量均大于商品酵母。C3是酯類含量最高的商品酵母(16.24 mg/L)。酯類物質按其結構可以分為乙酸酯和脂肪酸乙酯兩類,W3的乙酸酯含量明顯高于其他,而脂肪酸乙酯含量較高的是W7、W6和W2。野生酵母生成脂肪酸乙酯的含量高于商品酵母的現象與Torrens[15]的報道一致,但關于乙酸酯的報道卻相反,這恰恰說明了野生酵母的特異性差異。

2.5.2醇類物質高級醇在主要揮發性物質中所占的比例最大,均占92%以上。高級醇主要是通過酵母的氨基酸降解途徑生成[16],當葡萄酒中高級醇的含量低于300 mg/L時,會增加香氣的復雜性,對葡萄酒的品質有積極作用[17]。高級醇含量在不同酵母之間存在顯著性差異(p<0.05),W2和C1的高級醇含量最高,分別是306.94、289.05 mg/L,C3的含量最低(200.36 mg/L)。大多數野生酵母和商品酵母C5的高級醇含量都在260～270 mg/L。Callejon研究了4株野生酵母和1株商品酵母,發現生成高級醇含量最高的是野生酵母,最低的是商品酵母[18]。異丁醇、異戊醇和2-苯乙醇都是比較重要的高級醇[11]。異丁醇具有青草的香氣,W6的含量最高(23.14 mg/L),W1含量最低(12.39 mg/L)。異戊醇在所有揮發性物質中的含量最高,這與Sangeeta的研究一致[19],有苦杏仁味,是構成葡萄酒香氣骨架的主要物質[20]。異戊醇含量最高和最低的分別是W2(274.85 mg/L)和C3(177.67 mg/L)。2-苯乙醇有著玫瑰花的香味,C1的含量最高(20.86 mg/L),C3的含量最低(8.19 mg/L)。

2.5.3酸類物質有機酸在主要揮發性物質中占的比例較低,但對葡萄酒香氣的平衡非常重要,是構成葡萄酒香氣的基礎[21]。葡萄酒中的有機酸主要有兩個來源:葡萄果實和酵母合成,酵母生成的有機酸主要是偶數碳的直鏈脂肪酸[11]。有機酸含量最高的是W6(1.15 mg/L),最低的是W5(0.52 mg/L)。這與有關報道中商品酵母產酸高的現象不一致[4]。在商品酵母中,C3的有機酸含量最高(1.04 mg/L)。辛酸對有機酸的貢獻最大,占到40%左右,而另外3種有機酸所占比例差不多。酸類物質往往帶有不舒適的氣味,辛酸具有刺鼻的陳腐味。W7的辛酸含量最高(0.58 mg/L),W5最低(0.19 mg/L)。

以上數據分析顯示,各酒樣在揮發性物質種類和主要揮發性物質含量上都存在差異。實驗用于釀造各葡萄酒的原料和工藝條件是一致的,不同之處在于所接種的釀酒酵母不同,因此可以認為差異是由釀酒酵母引起的。釀酒酵母通過多種方式影響著葡萄酒的風味:a.代謝可產生一系列揮發性物質;b.釋放葡萄果實中的一些揮發性物質前體;c.酵母細胞自身作用[22]。葡萄酒中的酯類、高級醇和揮發酸等物質主要是在發酵階段由酵母產生的[23-24]。酯類物質是由醇類和酰基輔酶A在酶的催化作用下合成的[25];高級醇主要是通過降解代謝途徑和合成代謝途徑合成[26];揮發酸則是高級脂肪酸裂解或醇、醛氧化的產物[27]。這些物質的合成反應都需要酵母體內相關酶的參與,這些酶的數量和活性可能決定著產物的生成量,進而決定著葡萄酒中揮發性物質的成分和含量。

2.6感官品評

品評人員對各葡萄酒的感官特征進行定量描述分析,數據統計分析結果見圖1。從圖1中可以看出,各酒樣在7個感官特征中所表達的強度不同。果香和草本在各葡萄酒中均表現的最為強烈,其次是胡椒和花香。對于果香,C1、C2、C5和W2、W7的強度明顯高于其他;而對于草本,C4和W2、W3的強度較大;花香特征強度較大的是C1、C2和W2;胡椒特征強度較大的是C2和W1、W5。香草、酵母味和脂肪味在各葡萄酒之間的差異性不大。W2的果香和花香都比較明顯,這與其酯類含量最高的實驗數據相符;草本味則與高級醇有關,W2的高級醇含量最高,故其草本味較明顯;酸類物質在葡萄酒中所占比例較小,其感官特征不易察覺,但酸類物質往往與脂肪味有關[28],品評結果中脂肪味較明顯的正是脂肪酸含量高的W6。由此可見葡萄酒香氣的儀器分析數據與感官分析結果有一定的相關性,但葡萄酒的香氣是各種揮發性物質共同作用的結果,是許多復雜過程的最終產物,尚需要更加深入的研究去明確兩者之間的關系。

圖1　各葡萄酒感官分析數據圖Fig.1　Sensory analysis data of wines

3　結論

通過對5株商品釀酒酵母(C1～C5)和7株野生釀酒酵母(W1～W7)的發酵特性、耐受性和各葡萄酒基本指標的比較分析,結果表明,當酒精度為14%時,野生釀酒酵母的耐受性強于商品釀酒酵母,但當酒精度進一步提高時,野生釀酒酵母的耐受性不如商品釀酒酵母;野生釀酒酵母的SO2耐受性明顯不如商品釀酒酵母;用各釀酒酵母所釀葡萄酒的基本指標差別不大。

采用HS-SPME和GC-MS聯用技術對各葡萄酒的揮發性物質進行定量定性分析,結果表明,各葡萄酒中揮發性物質的組成成分相差不大,但在含量上存在差異,野生釀酒酵母主要揮發性物質的總含量要高于商品釀酒酵母。對于葡萄酒中的3類主要揮發性物質—酯類、醇類和酸類,其含量最高的均為用野生釀酒酵母釀造的葡萄酒,其中W2和W7最為突出。感官分析結果表明,C1、C2和W2的果香、花香較為突出,C4和W2具有明顯的草本味,C2和W1的胡椒味較強。另外,本實驗還證明了野生釀酒酵母應用的可行性,為野生釀酒酵母的進一步實用提供了理論依據。

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Study on volatile components of wine fermented with wild and commercialSaccharomycescerevisiaeyeasts

LIU Jun-xi1,2,JIANG Kai-kai1,2,HAN Ai-qin1,LI Rui-rui1,2,ZHAO Xin-jie1,SUN Yu-xia2,*,WANG Shi-ping2

(1.Shandong Key Laboratory of Microbial Engineering,Qilu University of Technology,Ji’nan 250353,China;2.Institute of Agro-Food Science and Technology,Shandong Academy of Agricultural Sciences,Key Laboratory of

The volatile components of the red wine fermented with 5 commercialSaccharomycescerevisiaeyeast strains and 7 wildSaccharomycescerevisiaeyeast strains were determined by head space solid phase microextraction(HS-SPME)followed by the gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS). The results showed that the compositions of volatile components among different wines under different yeast strains were similar,while the contents of volatile components were significant different,and the total content of major volatile components in wine under wild yeast was higher than that under commercial yeast. Furthermore,the content of esters,alcohols and acids in wines fermented with wild yeast strains,which were three kinds of major volatile components of wine,were higher than wines under commercial yeast strains,especially W2 and W7. The sensory evaluation showed that the fruity and floral aroma of C1,C2 and W2 were outstanding,the herbal odour of C4 and W2 were obvious,whereas the peppery odour of C2 and W1 were strong.

Saccharomycescerevisiae;wine;volatile components;HS-SPME;GC-MS

2015-12-28

劉峻溪(1991-)，男，在讀碩士研究生，研究方向：現代釀酒技術，E-mail：liujunxi91@163.com。

孫玉霞(1973-)，女，副研究員，研究方向：釀酒技術和酒類風味物質的研究，E-mail：sunyuxia1230@163.com。

山東省重點研發計劃項目(2015GNC113010)；山東省農業重大應用技術創新課題；山東省現代農業產業技術體系水果產業創新團隊項目(SDAIT-03-021-12)；泰山學者工程專項經費。

TS261.1

A

1002-0306(2016)12-0226-08

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.035