通過粗壯脈紋孢菌發酵改善豆粕營養結構的研究

任志青,鄧澤元,宋瀝文,楊建遠,2,劉　蓉,范亞葦,*

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.九江學院藥學與生命科學學院,江西九江 332000)

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通過粗壯脈紋孢菌發酵改善豆粕營養結構的研究

任志青1,鄧澤元1,宋瀝文1,楊建遠1,2,劉蓉1,范亞葦1,*

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.九江學院藥學與生命科學學院,江西九江 332000)

以粗壯脈紋孢菌發酵豆粕為研究對象,探討豆粕在發酵過程中主要營養成分及其抗營養因子的變化情況。研究結果表明,隨著發酵時間的延長,粗纖維降解率和粗蛋白含量總體呈上升趨勢,粗脂肪含量呈下降趨勢,可溶性總糖含量則先呈下降趨勢,下降至谷底后又逐漸增加,這些變化規律是由粗壯脈紋孢菌產的纖維素酶引起的;類胡蘿卜素含量隨著發酵時間的延長而上升,植酸含量下降至12 h后趨于穩定,胰蛋白酶抑制劑活性降低至在48 h后檢測不出。發酵豆粕營養成分和抗營養因子的變化規律為豆粕的進一步加工提供了理論依據。

粗壯脈紋孢菌,豆粕,營養成分,抗營養因子

豆粕是以大豆為原料提取豆油后經過熱處理與干燥所得到的一種副產品[1]。豆粕因其蛋白含量豐富,價格低廉,產量高,成為優良的植物蛋白飼料。豆粕是我國畜禽最為廣泛使用的優質植物蛋白質原料,大約85%的豆粕都被用作牲畜與家禽的飼料[2]。研究表明,豆粕內含的多種氨基酸在不額外加入動物性蛋白的情況下就足以滿足家禽和家畜對營養的需求。豆粕的主要成分為:粗蛋白43.0%～48.0%,脂肪1.0%～2.0%,碳水化合物10.0%～15.0%,多種礦物質(如鈣、磷、銅、鐵等),少量的維生素(如A,B,B2),以及動物體內必需的氨基酸,尤其是其他植物性飼料易缺的賴氨酸,其含量高達2.5%～2.8%[3]。但豆粕中的抗營養因子會抑制動物體內某些消化酶的活性并與營養物質發生一系列化學反應,降低飼料利用率,造成消化不良,或者破壞動物的器官,從而影響禽畜,特別是幼齡禽畜的生長[4],是限制豆粕利用的關鍵問題。通過微生物發酵,可以提高豆粕的營養物質,同時還可以降低抗營養因子含量或活性,使豆粕的利用率大大地提高了。用于發酵的微生物種類較多,目前國內外多使用霉菌屬、酵母菌屬、芽抱桿菌屬和乳酸菌屬等。尹慧君[5]研究了米曲霉A-9005、黑曲霉AS3.350、枯草芽孢桿菌1389分別發酵豆粕,只是測定了發酵前后的部分營養成分和抗營養因子,有的抗營養因子并未完全消除。大部分文獻[6-8]研究微生物發酵豆粕主要集中在發酵前和發酵后兩個階段的成分對比,對發酵過程中豆粕營養成分和抗營養因子變化的報道還較少。本實驗室團隊研究了粗壯脈紋孢菌發酵豆渣、米糠、啤酒糟、紅薯渣、山藥皮等原料,能產生高活力纖維素酶和高產量的類胡蘿卜素,而且發現該菌體生長所需的營養條件簡單、原料成本低、發酵周期短、實際生產過程容易控制,極具開發價值[9-10]。不過并未對粗壯脈紋孢菌發酵豆粕進行研究,該菌是否能消除豆粕中抗營養因子以及改善豆粕的營養結構還尚待研究。所以本研究利用產纖維素酶和類胡蘿卜素能力較強的粗壯脈紋孢菌(Neurosporacrassa)發酵豆粕,通過對發酵過程中營養成分及抗營養因子的測定,全面了解發酵過程中粗壯脈紋孢菌發酵豆粕的情況,旨在提高豆粕的營養價值,降低豆粕中抗營養因子的含量或活性,為粗壯脈紋孢菌發酵豆粕生產高附加值飼料提供參考依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

豆粕由江西茂昌實業有限公司提供,大豆提取豆油后的副產品,其主要成分為粗蛋白,脂肪和碳水化合物;粗壯脈紋孢菌(NeurosporacrassaCGMCC 3088)由本實驗室篩選保存;Na-苯甲酰-DL-精氨酸-對硝基酰胺鹽酸鹽(BAPNA)、植酸二鉀鹽Sigma試劑;胰蛋白酶(酶活≥3000 units/mg)Aladdin試劑;硫酸、鹽酸、丙酮、無水乙醇、無水乙醚、苯酚、葡萄糖等均為分析純試劑。

AR323CN型電子天平奧豪斯儀器(上海)有限公司;722G型可見光分光光度計上海精密科學儀器有限公司;KDY-9820型凱氏定氮儀廈門精藝興業科技有限公司;SXT-06型索氏抽提器上海洪紀儀器設備有限公司;LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫療器械廠;SHZ-D(Ⅲ)型循環水式真空泵鞏義市英峪華儀器廠;TDL-5-A型離心機上海安亭科學儀器廠;HWS-150型恒溫恒濕箱上海精宏實驗設備有限公司;PHS-25型數顯pH計上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1發酵豆粕的制備豆粕經過烘干、粉碎、過60目篩后,與水以1∶2.5(m/v)的比例充分混合并攪拌,于121 ℃滅菌30 min,按豆粕質量分數的2%接種粗壯脈紋孢菌,在30 ℃、濕度為70%的條件下發酵(每隔12 h取一次樣),在45 ℃下烘干至恒重,粉碎后備用。

1.2.2營養成分的測定

1.2.2.1豆粕回收率豆粕滅菌接種后每隔12 h取1次樣品,于45 ℃下烘干至恒重,稱其質量。回收率計算公式如下:

1.2.2.2粗蛋白含量的測定采用凱氏定氮法(GB 5009.5-2010)測定。

1.2.2.3粗脂肪含量的測定采用索氏抽提法(GB/T 5009.6-2003)測定。

1.2.2.4可溶性總糖的測定采用苯酚-硫酸法測定[11]。

1.2.2.5粗纖維的測定及粗纖維降解率的計算[12]豆粕經粗壯脈紋孢菌發酵后,以粗纖維降解率為指標考察粗纖維降解效果,其計算公式如下:

式中,m0表示培養基發酵前粗纖維總質量(g);m表示培養基發酵后粗纖維總質量(g)。

1.2.2.6類胡蘿卜素含量的測定[10]用0.8 mol/L的HCl溶液將烘干粉碎的0.5000 g發酵豆粕潤濕,后用水洗至中性,離心取其濾渣。加入10 mL丙酮,浸提30 min,離心取其上層清液。重復提取一次,所得提取液與第一次的提取液合并。用丙酮將提取液定容25 mL,調至分光光度計波長為461 nm,測定其吸光度。類胡蘿卜素含量的計算公式:

類胡蘿卜素含量(μg/g干物質)=(A×V×D)/(0.16×W)

式中,A表示類胡蘿卜素最大吸收波長下的吸光值;V表示提取所用的容積體積(mL);D表示測定試樣時的稀釋倍數;W表示培養物的質量(g);0.16為類胡蘿卜素的克分子消光系數。

1.2.3抗營養因子的測定

1.2.3.1植酸含量的測定采用三氯化鐵比色法[13]。配制0.1 g/L植酸標準溶液液。取0.1 g/L植酸標準溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.4 mL于10 mL玻璃試管中,分別加蒸餾水3.0、2.8、2.6、2.4、2.2、2.0、1.6 mL,加1 mL 0.03% FeCl3·6H2O-0.3%磺基水楊酸,搖勻,于分光光度計500 nm下測定吸光度。以植酸濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線。準確稱取2.000 g樣品,加入40 mL 1.2% HCl-10% Na2SO4溶液于室溫下攪拌浸提2 h,4000 r/min離心30 min,取上清液于4 ℃冰箱中備用。取3 mL樣品稀釋液加1 mL 0.03% FeCl3·6H2O-0.3%磺基水楊酸試劑,混勻后于500 nm波長下測定吸光度。利用植酸標準曲線回歸方程即可求得溶液中植酸的含量。

1.2.3.2脲酶活性的測定[14]準確稱取經干燥粉碎的發酵豆粕0.200 g,裝入比色管中,加入10 mL 0.5 mol/L尿素緩沖液(pH7.0),迅速蓋上蓋子劇烈搖動。然后將比色管置于(30±5) ℃的恒溫水浴鍋中,30 min。另稱取等量試樣放入另一支比色管中,加入10 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH7.0),混合均勻,置于水浴鍋中,30 min,為空白對照,每隔5 min,搖勻一次,30 min后,取出比色管將上清液倒入小燒杯中,取出5 min時,用pH計測pH。計算公式:脲酶活性=樣品使尿素分解后樣液的pH-空白樣液的pH。

1.2.3.3胰蛋白酶抑制劑活性的測定待檢樣品的準備:參照趙元[15]等,取0.5 g樣品,溶解50 mL蒸餾水中,200 r/min震蕩30 min。取10 mL上清液,加入相同體積的Tris-CaCl2緩沖液,振蕩2～3 min,過濾。用蒸餾水稀釋濾液,保證胰蛋白酶的抑制率達到30%～70%,從而使胰蛋白酶抑制劑(Trypsin inhibitor,簡稱TI)的相對標準差達3.5%。處理樣品為0.5～1.5 mg/mL。

測定方法參考Liu和Markalds[16]方法,進行TI活性檢測。取1.0 mL樣品稀釋液,加入0.5 mL胰蛋白酶溶液和2 mL BAPNA溶液,10 min后,用30%的醋酸終止反應(0.5 mL),然后測410 nm處的吸光度(As410)。利用測定胰蛋白酶的活性,進而推算樣品中胰蛋白抑制因子的含量。以蒸餾水替代樣品,得到相應的吸光度(Ar410)作為對照值。活性計算:胰蛋白酶抑制劑活性(TUI/mg樣品)=[(Ar410-As410)×100]/mg樣品。

1.3數據統計分析

采用SPSS13.0對實驗結果進行分析處理。以p<0.05為顯著標準平均值,采用One-way ANOVA模型的Duncan氏法多重比較分析固態發酵工藝對豆粕各營養成分和抗營養因子的影響,結果用“平均值±標準差”表示。

2　結果與分析

2.1營養成分的變化

2.1.1豆粕回收率的變化粗壯脈紋孢菌可利用豆粕進行增殖。測定發酵豆粕的回收率,可以反映粗壯脈紋孢菌在不同時期對豆粕的利用情況。從圖1可以看出,整個發酵過程大致可以分為3個階段:第1階段:前12 h,豆粕消耗速度很快,回收率快速降至86.6%,表明此時間段粗壯脈紋孢菌快速利用豆粕進行增殖;同期觀察菌體生長情況,可以看見大量菌絲生成。第2階段:12～84 h,此階段豆粕培養基消耗速度減緩,回收率從86.6%逐漸降至76.5%。第3階段:發酵84～96 h后,回收率變化較小,從75.6%降至74.5%。總之,豆粕的回收率在70%以上,說明粗壯脈紋孢菌對豆粕的消耗量較小。

圖1　發酵過程中培養基回收率的變化Fig.1　Changes of the mediumrecovery rate in fermentation process

2.1.2粗蛋白含量的變化本實驗采用凱氏定氮法測定粗壯脈紋孢菌發酵豆粕過程中粗蛋白的含量,新鮮豆粕粗蛋白含量約為50.39 g/100 g,發酵96 h粗蛋白含量上升至61.19 g/100 g,提高了約11 g/100 g,有顯著性差異。

由圖2可知,發酵0～12 h,粗蛋白含量快速上升。發酵12～84 h,粗蛋白含量增速減緩,并在60 h時達到穩定。發酵84～96 h,粗蛋白含量急劇上升。原因可能是在發酵過程中,菌體通過消耗豆粕中的蛋白質、脂肪和碳水化合物等生長繁殖,由于粗壯脈紋孢菌的生長導致發酵豆粕中菌體蛋白質合成大量增加,提高了發酵豆粕中蛋白質的含量。其次發酵過程中消耗部分碳源,使其碳水化合物比例下降,從而提升了粗蛋白含量的比例。

圖2　發酵過程中粗蛋白含量的變化Fig.2　Changes of the crude proteincontent in fermentation process

2.1.3粗脂肪含量的變化從圖3可以看出,發酵前12 h,粗脂肪含量隨著培養時間的增加而減少,從2.44 g/100 g減少到最低點1.38 g/100 g;12～36 h后,粗脂肪含量變化不大,維持在1.5 g/100 g左右,發酵48 h后又開始上升,60 h時達到1.96 g/100 g。在60～84 h階段,粗脂肪含量急劇下降達到最低值0.90 g/100 g。84～96 h后又上升到1.11 g/100 g。總體趨勢看粗脂肪含量比發酵前有所下降,原因可能是發酵前期,由于菌體繁殖生長需要消耗能源,部分脂肪分解產生能量供菌體生長需要,部分脂肪合成菌體組成成分,脂肪含量相對減少,而發酵后期,脂肪含量變化趨于平緩;其次,發酵過程中豆粕的其它主要成分蛋白質和碳水化合物等一直在變化中,所以后期脂肪的相對含量變化沒有規律。

圖3　發酵過程中粗脂肪含量的變化Fig.3　Changes of the crude fat content in fermentation process

2.1.4可溶性總糖含量的變化可溶性總糖含量變化如圖4所示,可溶性總糖含量在前24 h內未有明顯變化,基本穩定在21.84 g/100 g左右;在24～60 h內,可溶性總糖含量顯著下降,最低至2.04 g/100 g;在60 h以后,可溶性總糖含量緩慢上升,至9.24 g/100 g,84 h后含量趨于平穩,基本不變。在24～60 h內,導致可溶性總糖含量顯著下降的原因是粗壯脈紋孢菌繁殖發酵過程中消耗糖類所致。粗壯脈紋孢菌發酵過程中可產生纖維素酶,一般在發酵60～84 h內達到峰值[17]。在本實驗中,60 h后總糖含量開始上升,發酵產生的纖維素酶降解纖維素產生單糖并且產生的單糖含量大于消耗的單糖含量,總體上可溶性總糖含量增加。到84 h后,纖維素酶活性降低,故可溶性總糖含量不再增加,趨于平穩。

圖4　發酵過程中可溶性總糖含量的變化Fig.4　Changes of the total solublesugar content in fermentation process

2.1.5粗纖維降解率的變化如圖5所示,0～24 h階段,粗纖維以很快的速度被降解了,降解率至44.33%;24～84 h,粗纖維降解率隨著發酵時間緩慢增長,從48.11%緩慢增至69.46%,此時粗壯脈紋孢菌對豆粕中的粗纖維降解能力逐漸減弱;84～96 h,粗纖維降解率達到穩定狀態,96 h的粗纖維降解率為71.62%,此階段豆粕中粗纖維基本不被降解。這一變化過程同豆粕回收率的變化相似,表明發酵前24 h,粗壯脈紋孢菌利用豆粕快速增殖,同時菌絲能夠分泌纖維素酶降解豆粕中的纖維素。

圖5　發酵過程中粗纖維降解率的變化Fig.5　Changes of the degradation rate of crude fiber in fermentation process

2.1.6類胡蘿卜含量的變化豆粕中基本不含類胡蘿卜素,李紅艷等[18]研究粗壯脈紋孢菌經生長后,孢子中可產生一定量的類胡蘿卜素。如圖6所示,前36 h類胡蘿卜素含量呈緩慢上升趨勢,最高達到23.125 μg/g。隨著發酵時間的增加,在36～48 h內,類胡蘿卜素含量急劇增加,最高達到70.625 μg/g。其后,在48～60 h內,類胡蘿卜素含量下降到39.063 μg/g。發酵至60 h后,類胡蘿卜素含量變化不大,基本穩定在47 μg/g左右。高氧、強光、碳源或氮源的缺乏、水分的缺乏等外界刺激條件可誘導粗壯脈紋孢菌產生大量的類胡蘿卜素[19]。在本實驗中,36～48 h內類胡蘿卜素含量顯著增加可能與碳源、氮源及水分的缺乏有關;在60 h后,類胡蘿卜素含量降低至基本不變,可能原因是類胡蘿卜素具有還原性,部分被氧化,并且氧氣的減少會影響粗壯脈紋孢菌產生類胡蘿卜素。

圖6　發酵過程中類胡蘿卜素含量的變化Fig.6　Changes of carotenoids content in fermentation process

2.2抗營養因子

抗營養因子(植酸、脲酶、胰蛋白酶抑制劑)在發酵過程中的變化如表1所示。發酵過程中,0～12 h,植酸含量迅速從6.90 g/100 g減少至1.36 g/100 g,呈顯著性差異,說明粗壯脈紋孢菌能很好地降解植酸;12 h以后,植酸含量變化趨于穩定。Skrede等[20]報道,乳酸菌發酵谷物可以顯著降低植酸含量。本研究中豆粕經粗壯脈紋孢菌發酵48 h后,植酸含量迅速從6.90 g/100 g減少至1.16 g/100 g,表明粗壯脈紋孢菌也能很好地降解植酸。

表1　抗營養因子在發酵過程中的變化

注:角標含有不同字母的每列數據之間差異顯著(p<0.05)。

發酵過程中,脲酶活性有所降低,脲酶活性由0.05降低到0.01,但無顯著性差異。本實驗檢測出的脲酶活性較小,推測是由于實驗所用原料是高溫豆粕,脲酶在豆粕加工中活性已基本被破壞。

發酵過程中,0～12 h,胰蛋白酶抑制劑活性迅速從180 TUI/mg降低到45 TUI/mg,說明粗壯脈紋孢菌能快速降解胰蛋白酶抑制劑;至60 h以后,胰蛋白酶抑制劑活性檢測不出,表示粗壯脈紋孢菌能完全

降解胰蛋白酶抑制劑。Hackler等[21]研究認為,大豆產品中胰蛋白酶抑制劑90%以上的活性被消除,方可認為其是安全的。劉海燕[22]報道,乳酸菌發酵72 h后,豆粕中胰蛋白酶抑制劑活性僅為發酵前的1%。本實驗中豆粕經粗壯脈紋孢菌發酵48 h后胰蛋白酶抑制劑已經檢測不出,表明粗壯脈紋孢菌能完全降解胰蛋白酶抑制劑。

3　結論

通過追蹤粗壯脈紋孢菌發酵豆粕的過程探討豆粕在發酵過程中營養成分和抗營養因子的變化,研究結果表明:通過粗壯脈紋孢菌發酵可以改善豆粕營養成分和降低抗營養因子活性或含量,使豆粕中粗蛋白含量增加,增加粗纖維降解率,明顯增加類胡蘿卜素含量,抗營養因子植酸含量和胰蛋白酶抑制劑活性顯著降低,脲酶活性下降,為豆粕的進一步加工提供了理論依據。

粗壯脈紋孢菌發酵豆粕過程中產生的高活力纖維素酶能降解粗纖維,使之適口性更佳。并且發酵過程中蛋白質含量和類胡蘿卜素含量均升高,大大提高了豆粕作為飼料的營養價值和生物抗氧化性。抗營養因子含量或活性的降低,合理地改善了豆粕的營養結構,使其利用率大大提高,具有一定的環境與社會經濟效益。發酵48 h的豆粕中類胡蘿卜素含量達到最高點,粗蛋白含量和纖維素降解率也較高,同時抗營養因子含量或活性較低,故發酵48 h的豆粕最適合用來飼養家禽。

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Study on fermented byNeurosporacrassato improve structural style of soybean meal nutrition

REN Zhi-qing1,DENG Ze-yuan1,SONG Li-wen1,YANG Jian-yuan1,2,LIU Rong1,FAN Ya-wei1,*

(1.State Key Lab of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China2.College of Pharmaceutical and Life Sciences,Jiujiang University,Jiujiang 332000,China)

The objective of this study was to evaluate the change rules of nutritional components and anti-nutritional factors inNeurosporacrassafermentation process of soybean meal. The results indicated the degradation rate of crude fiber and the crude protein content were increased along with fermentation time growing. The crude fats were decreased. The total soluble sugar were decreased to a bottom and then increased later. These changes were caused by cellulase produced byNeurosporacrassa. The content of carotenoids increased with the extension of fermentation. The content of phytic acid declined,and reached to steady state after 12 h. The activity of trypsin inhibitor decresed,and could not be detected after 48 h. The change rules of nutrition components and anti-nutritional factors inNeurosporacrassafermentation of soybean meal would provide a theoretical basis for the further processing of soybean meal.

Neurosporacrassa;soybean meal;nutritional components;anti-nutritional factors

2015-12-18

任志青(1990-)，女，碩士研究生，主要從事微生物發酵方面的研究，E-mail:15279115063@163.com。

范亞葦(1969-)，女，副教授，主要從事食品營養與微生物方向研究，E-mail:fanyw6601@sina.com。

食品科學與技術國家重點實驗室基金項目(SKLF-ZZA-201303)；江西省科技廳項目(20133BBF60002)；江西省教育廳科學技術研究項目(GJJ14147)。

TS210.9

B

1002-0306(2016)12-0222-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.034