大鯢活性肽酶法制備工藝優化及抗氧化性分析

張佳嬋,王昌濤,3,*,李　萌，趙　丹

(1.北京工商大學理學院,北京 100048;2.植物資源研究開發北京市重點實驗室,北京 100048;3.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京工商大學，北京 100048)

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大鯢活性肽酶法制備工藝優化及抗氧化性分析

張佳嬋1,2,王昌濤1,2,3,*,李萌1，2，趙丹1,2

(1.北京工商大學理學院,北京 100048;2.植物資源研究開發北京市重點實驗室,北京 100048;3.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京工商大學，北京 100048)

研究了堿性蛋白酶水解制備大鯢活性肽的工藝條件以及大鯢活性肽的理化性質。以水解度為指標,通過Box-Behnken實驗設計方法,確定最佳工藝條件為:酶解溫度50 ℃,酶解時間1.5 h,酶添加量70 U/g,pH8.91,液料比2∶1(mL/g),蛋白酶解液的水解度值為DH=19.61%±0.12%。所得大鯢活性肽的蛋白質含量為52.40%±1.28%。HPLC分析可知該大鯢活性肽的分子量多分布在1000.00 u以內。在30 mg/mL,大鯢活性肽對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率分別為81.83%、56.27%。

大鯢,活性肽,酶解,水解度,抗氧化作用

大鯢(Andriasdavidianus)俗稱娃娃魚,屬兩棲類(Amphibia)有尾目(Caudata)隱鰓鯢科(Cryptobrachidae),主要分布于長江中上游、珠江中上游及漢水上游地區[1],屬國家二類保護動物[2]。2004年頒布的《野生動物保護法》一方面嚴厲打擊了破壞大鯢資源以及捕殺、販賣等一系列非法犯罪行為,另一方面也鼓勵馴養繁殖和合法合理經營。目前,僅湖南省就有30多家大鯢馴養繁殖企業,年繁殖能力已達4萬到5萬尾[3]。國務院野生動物保護辦公室批準極小數的養殖專業戶利用人工養殖子二代以下的無繁殖能力的個體、傷殘體進行科研、加工和利用,這使得從大鯢體內提取營養成分為人類服務成為可能。

目前對大鯢的研究主要集中在其資源狀況[4]、生物學習性[5-6]、繁殖[7]、病害[8]以及功能基因[9-10]方面,有關大鯢營養價值和食用價值的研究也有部分報道[11-15]。對大鯢資源的深加工方面主要為宰殺后提取皮、肉、骨,利用方法較為簡單且附加值低[16]。本文以大鯢肉為原料,先后利用二次酶解技術,對大鯢肉進行脫脂和水解,并對第二次酶解技術進行了條件優化,同時對制備的大鯢活性肽進行主要成分分析和分子量分布測定,最后對抗氧化性進行了研究,為其在保健食品中的應用奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

大鯢浙江永強養殖公司提供;脂肪酶(1.0×105U/mL)、堿性蛋白酶(7.4×104U/mL)Novozymes(北京)酶制劑公司;牛血清蛋白、維生素B12、氧化型谷胱甘肽(純度均大于99%)北京迪朗生化科技有限公司;其他試劑均為分析純,購于國藥集團化學試劑有限公司。

ZN-048型小型粉碎機上海安亭科學儀器廠;TB-214電子天平北京賽多利斯儀器系統有限公司;PHS-3C pH計上海雷磁儀器廠;UVmini-1240紫外分光光度計日本島津;高速冷凍離心機日本立牌SCR20BC型;LGJ-10冷凍干燥機上海醫用分析儀器廠;Buchi全自動凱氏定氮儀瑞士Buchi公司;Waters 2695高效液相色譜儀美國Waters公司。

1.2實驗方法

1.2.1制備大鯢活性肽的工藝流程大鯢肉→清洗→絞碎→按液料比3∶1(mL/g)加水勻漿→pH4,40 ℃脂肪酶酶解2 h脫脂→沸水浴滅酶15 min→一定條件下蛋白酶酶解→沸水浴滅酶15 min→5000 r/min離心20 min→過濾→酶解液→冷凍干燥得淡黃色粉末。

1.2.2酶法制備大鯢活性肽的單因素實驗

1.2.2.1酶添加量的單因素實驗以水解度(DH)為指標,固定反應條件pH8,液料比為3∶1(mL/g),酶解時間為3 h,酶解溫度45 ℃,酶添加量分別為35、70、140、210、280 U/g,考察酶添加量對大鯢活性肽制備的影響。

1.2.2.2酶解溫度的單因素實驗以水解度(DH)為指標,固定酶添加量為140 U/g,pH8,液料比為3∶1(mL/g),酶解時間為3 h,酶解溫度分別為25、35、45、55和65 ℃,考察溫度對大鯢活性肽制備的影響。

1.2.2.3pH的單因素實驗以水解度(DH)為指標,固定酶添加量為140 U/g,液料比為3∶1(mL/g),溫度45 ℃,酶解3 h,pH分別為7、8、9、10、11,考察pH對大鯢活性肽制備的影響。

1.2.2.4液料比的單因素實驗以水解度(DH)為指標,固定酶添加量為140 U/g,pH8,45 ℃,酶解時間為3 h,液料比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1(mL/g),考察液料比對大鯢活性肽制備的影響。

1.2.2.5酶解時間的單因素實驗以水解度(DH)為指標,固定酶添加量為140 U/g,液料比為3∶1(mL/g),pH為8,酶解溫度為45 ℃,酶解時間分別為1、2、3、4、5 h,考察酶解時間對大鯢活性肽制備的影響。

1.2.3響應面法優化酶法制備大鯢活性肽的工藝條件利用甲醛滴定法測定所得酶解液的水解度(DH)[17]。

在單因素實驗的基礎上,選擇對水解度影響較大的pH、溫度、酶解時間和酶添加量4個因素為考察對象進行Box-Behnken設計,優化大鯢活性肽的最佳酶解工藝，因素水平見表1。

表1　Box-Behnken設計因素水平表

1.2.4理化性質的測定含水量的測定采用常壓干燥法,具體參照GB/T5009.3-2010;灰分的測定采用干法灰化法,參照GB/T5009.4-2010;脂肪含量的測定采用索氏提取法,參照GB/T5009.6-2003;蛋白質含量的測定采用凱氏定氮法,參照GB/T5009.5-2010。

1.2.5大鯢活性肽分子量的測定用HPLC檢測大鯢活性肽的相對分子質量分布。

色譜條件:色譜柱TsK gel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm,流動相為乙腈∶水∶三氟乙酸為30∶70∶0.1(v/v/v),檢測波長為280 nm,流速為1.00 mL/min,柱溫30 ℃。

樣品制備:以流動相為溶劑配制濃度為5.00 mg/mL的樣品,再用微孔膜(0.45 μm)過濾后進樣。

標準樣品的制備:將牛血清蛋白(Mr 67000)、維生素B12(Mr 1335)、氧化型谷胱甘肽(Mr 614)配成混標,每種物質含量均為5.00 mg/mL。

1.2.6大鯢多肽凍干粉的制備采用最優工藝條件制備大鯢多肽,對所得大鯢蛋白水解液進行冷凍干燥,條件為-80.00 ℃,0.03 mBar,48.00 h。

1.2.7體外抗氧化活性實驗分別采用NBT法和脫氧核糖法測定大鯢多肽的超氧陰離子自由基和羥自由基的清除能力[18-19]。

2　結果與分析

2.1堿性蛋白酶制備大鯢活性肽的單因素實驗

2.1.1酶添加量的確定圖1為不同酶添加量對大鯢蛋白水解度的影響。由圖1可知,在35～140 U/g范圍內,隨著酶添加量的增加,大鯢蛋白的水解度增高。在140～280 U/g范圍內,水解度不再隨著酶添加量的增大而增大,這可能是由于底物已全部與酶形成酶-底物復合物,沒有多余的底物與酶接觸。因此,綜合考慮,酶的最適添加量為140 U/g。

圖1　酶添加量對大鯢蛋白水解度的影響Fig.1　Effects of enzyme amounts on the degree of hydrolysis of giant salamander protein hydrolysates注:不同字母表示差異顯著(p<0.05);圖2～圖5同。

2.1.2酶解溫度對DH的影響不同酶解溫度對大鯢蛋白水解度的影響見圖2。由圖2可知,溫度為45～55 ℃范圍內的水解度最大,低于45 ℃時,隨著酶解溫度的升高水解度增加。超過55 ℃后,水解度緩慢下降,其可能原因是溫度過高使酶的蛋白質結構發生改變,導致活力降低[20]。

圖2　酶解溫度對大鯢蛋白水解度的影響Fig.2　Effects of reaction temperature on the degree of hydrolysis of giant salamander protein hydrolysates

2.1.3pH對DH的影響體系pH影響著酶和底物分子解離集團的解離狀態,適當的pH下酶與底物分子可以結合并促使反應進行。由圖3可知 pH為9～10時水解度最大,約為17.50%。pH低于9或高于10時,水解度均有所降低,可見pH=9為堿性蛋白酶催化得到大鯢活性肽的較適pH范圍。

圖3　pH對大鯢蛋白水解度的影響Fig.3　Effects of pH on the degree of hydrolysis of giant salamander protein hydrolysates

2.1.4液料比對DH的影響圖4為不同液料比(mL/g)對大鯢蛋白水解度的影響。圖4可知,液料比在2∶1、3∶1、4∶1時均保持較高的DH,且水平之間無顯著性差異。所以選取液料比為2∶1,作為后續響應面實驗條件。

圖4　液料比對大鯢蛋白水解度的影響Fig.4　Effects of the ratio of liquor to material on the degree of hydrolysis of giant salamander protein hydrolysates

圖5　酶解時間對大鯢蛋白水解度的影響Fig.5　Effects of reaction time on the degree of hydrolysis of giant salamander protein hydrolysates

2.1.5酶解時間對DH的影響本實驗研究了不同酶解時間處理下大鯢肉糜在堿性蛋白酶作用下的水解度。由圖5可知,在酶解初期的1 h內,蛋白質水解度急劇升高,而在1～5 h內變化較為緩慢。

2.2響應面法優化堿性蛋白酶酶解制備大鯢活性肽的工藝條件

采用響應面優化設計(Response Surface Methodology,RSM),對大鯢活性肽的酶法制備條件進行優化與統計分析。利用統計軟件Design-Expert 8.0進行數據擬合和分析,考察pH、溫度、液料比和酶解時間4個單因素的交互關系,尋求水解度可能達到的極大值,實驗設計和結果見表2。

表2　Box-Behnken設計與實驗結果

續表

通過二次模擬回歸系數計算,得到以水解度表示的二次回歸擬合方程:

DH=18.16+0.53A+0.14B+0.69C-0.12D-0.61AB-0.26AC-0.25AD+0.078BC-0.29BD-0.73CD-0.63A2+0.29B2-0.49C2-0.25D2

對表2中實驗結果進行統計分析,方差分析結果見表3。該模型p值=0.0132(p<0.05視為模型顯著),表明該模型高度顯著,可用來進行響應值預測。

表3　Box-Behnken設計模型方差分析

對于某一特定因素,F值越大,p值越小說明該因素越重要。由表4可知:A(pH)、C(酶解時間)CD、A2對酶法制備大鯢活性肽的影響顯著(p<0.05),B(酶解溫度)、D(酶添加量)、AB、AC、AD、BC以及BD的交互作用影響不顯著。

相互作用的響應面分析見圖6,酶解時間、酶添加量的交互作用顯著,其他因素的交互作用影響不顯著。根據擬合方程,可以得到最佳酶解工藝條件為:酶解溫度50 ℃,酶解時間1.5 h,酶添加量70 U/g,pH8.91,蛋白酶解液的水解度值為19.76%。

為了檢驗模型預測的準確性,在最佳制備條件下進行了3次實驗,其DH為 19.61%±0.12%,可見該模型能較好地預測實際合成情況。

2.3大鯢活性肽的理化性質研究

對原料大鯢肉和大鯢活性肽的成分進行比較分析,結果見表5。從表5可以看出,酶解處理得到的大鯢活性肽蛋白質含量高達52.40%±1.28%,脂肪含量最低,為0.14%±0.08%。灰分含量較高,達到10.01%±0.42%,這與含水量的降低有很大關系,也與酶解過程中因pH的調節導致生成鹽類有關。灰分的高含量限制了其在食品中的應用,有待于進一步的研究。

表4　二次模型回歸系數的顯著性檢驗

表5　常規成分分析

注:不同小寫字母表示大鯢肉和大鯢活性肽兩者在同一指標下有顯著差異(p<0.05)。

圖6　不同自變量交互作用對大鯢蛋白水解度影響的響應面圖Fig. 6　Response surface for the interaction effects of independent variables on the degree of hydrolysis of giant salamander protein hydrolysates

2.4大鯢活性肽的分子量分布

選用三種標準樣品,分別為牛血清白蛋白、維生素B12和氧化型谷胱甘肽。對這三種標準樣品(5 mg/mL)進行HPLC分析。根據凝膠柱滲透層析原理,分子量大的物質先被洗脫下來,具體分子量、分子量對數和洗脫時間詳見表6。

表6　三種標準樣品的分子量與洗脫時間的關系表

制作三種標準樣品的相對分子質量對數與標準樣品經HPLC的洗脫時間的關系曲線。采用最小二乘法,求出回歸直線方程為:

y=-0.4136x+7.1985(R2=0.9997)

其中,x代表洗脫時間,y代表分子量對數。

由圖7可以看出,大鯢活性肽樣品主要出現三個組分峰,洗脫時間分別為10.955、10.172、9.401 min,根據標準曲線計算出各峰組分的分子量分別為444.32、928.51、2042.90 u,根據峰面積計算該三種物質分別占44.68%、29.50%、17.58%,三者共占91.76%(表7)。

表7　大鯢活性肽的分子量分布情況表

圖7　大鯢活性肽的HPLC圖譜Fig.7　HPLC spectrpgam of giant salamander peptide

2.5大鯢活性肽對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除作用

由圖8可知,大鯢活性肽對兩種自由基均具有不同程度的清除作用。隨著添加濃度的增加,大鯢活性肽對兩種自由基的清除作用也隨之增強。濃度為15 mg/mL時,大鯢活性肽對超氧陰離子自由基清除率為32.29%;濃度為30 mg/mL 時,大鯢活性肽對羥自由基的清除率已達到81.83%,超氧陰離子自由基的清除率達到了56.27%。以上結果表明,大鯢活性肽具有較好的抗氧化作用。

3　結論

以大鯢肉為研究對象,利用脂肪酶對大鯢肉初

圖8　大鯢活性肽濃度對自由基的清除率作用Fig.8　Concentration of giant salamander peptide on free radical scavenging capability

步進行脫脂處理,然后利用蛋白酶酶解大鯢肉制備大鯢活性肽,通過響應面優化設計,得到了蛋白酶酶解最優工藝條件為:酶解溫度50 ℃、酶解時間1.5 h、酶添加量70 U/g、pH8.91。在此最優條件下,DH=19.61%±0.12%。本實驗同時對所得大鯢活性肽進行了常規成分分析,得出大鯢活性肽的蛋白質含量達到52.40%±1.28%,其中大鯢活性肽分子量有44.68%分布在444.32 u,29.50%分布在928.51 u,分子量多分布在1000 u以內;該活性肽對羥自由基和超氧陰離子自由基均具有不同程度的清除作用。有文獻記載小分子量多肽更有利于人體吸收和抗氧化活性的增強[21-22],這表明大鯢活性肽作為保健食品具有潛在的優勢。

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Optimal enzymatic preparation conditions and antioxidative activity of giant salamander bioactive peptide

ZHANG Jia-chan1,2,WANG Chang-tao1,2,3,*,LI Meng1,2,ZHAO Dan1,2

(1.School of Science,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China;2.Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development,Beijing 100048,China;3.Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

In this paper,enzymatic preparation conditions of giant salamander bioactive peptide and its physicochemical properties were studied. Based on the degree of hydrolysis,the preparation method was optimized by response surface methodology. The optimal temperature,the reaction time,the ratio of liquor to material,enzyme amounts,and pH were 50 ℃,1.5 h,2∶1(mL/g),70 U/g ,and pH8.91,respectively,the highest degree of hydrolysis was obtained,up to 19.61%±0.12%. Protein content of the bioactive peptide was 52.40%±1.28% and the molecule weight of the most bioactive peptide was below 1000 u. At the concentration of 30 mg/mL,the scavenging rates of giant salamander bioactive peptide against hydroxyl radical and superoxide anion were 81.83% and 56.27%,respectively.

giant salamander;bioactive peptide;enzymolysis;degree of hydrolysis;antioxidative activity

2015-11-09

張佳嬋(1987-)，女，碩士，實驗師，研究方向：食品生物技術，E-mail：xiaochan8787@163.com。

王昌濤(1975-)，男，博士，教授，研究方向：生物化工，E-mail：wangct@th.btbu.edu.cn。

質檢公益性行業科研專項(201310132)；質檢公益性行業科研專項(201410019)。

TS254.1

A

1002-0306(2016)12-0217-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.033