重組大腸桿菌產谷氨酰胺轉氨酶的發酵條件優化

舒　暢,羅水忠,2,蔡　靜,2,姜紹通,2,鄭　志,2,*

(1.合肥工業大學生食品科學與工程學院,安徽合肥 230009;2.安徽省農產品精深加工重點實驗室,安徽合肥 230009)

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重組大腸桿菌產谷氨酰胺轉氨酶的發酵條件優化

舒暢1,羅水忠1,2,蔡靜1,2,姜紹通1,2,鄭志1,2,*

(1.合肥工業大學生食品科學與工程學院,安徽合肥 230009;2.安徽省農產品精深加工重點實驗室,安徽合肥 230009)

以谷氨酰胺轉氨酶生產菌株重組大腸桿菌BL21(DE3)/mtg為研究對象,對工程菌的發酵產酶條件進行了優化。首先通過單因素實驗法,對培養基碳、氮源種類及濃度、培養溫度、初始pH、裝液量、接種量、誘導時機、誘導濃度、誘導溫度及誘導時間進行了優化;隨后采用Plackett-Burman設計從中篩選出3個關鍵影響因子:初始pH、培養溫度及誘導溫度;最后通過Box-Benhnken設計建立上述3個因子對谷氨酰胺轉氨酶比酶活的響應面模型。結果表明,最佳發酵條件為:葡萄糖5 g/L,酵母粉28 g/L,蛋白胨14 g/L,培養溫度34 ℃,初始pH7.0,裝液量50 mL(250 mL三角瓶),接種量5%,誘導時機4 h,IPTG濃度0.6 mmol/L,誘導溫度25 ℃,誘導時間14 h。在該條件下,優化后的谷氨酰胺轉氨酶比酶活達1.507 U/mg,為未優化前的1.56倍。

谷氨酰胺轉氨酶,重組大腸桿菌,發酵優化,響應面法

谷氨酰胺轉氨酶(Transglutaminase,EC 2.3.2.13,TGase)是一種催化酰基轉移反應的酶,它以谷氨酰胺殘基γ-羧酰胺基為?；w,催化蛋白質分子內、分子間的交聯,蛋白質和氨基酸之間的連接及蛋白質分子內谷氨酰胺基的水解,從而極大地改變蛋白質的功能性質[1],在肉制品、水產品和乳制品[2]等領域都有廣泛的應用前景,被譽為“21世紀超級粘合劑”。

TGase最初從動[3]、植物組織[4]中提取,但工藝復雜、產量低、分離成本高,不利于大規模工業化應用。自1989年Ando等[5]從茂源鏈霉菌(Streptomycesmobaraensis)中分離得到微生物來源的TGase(MTGase,MTG),至今已有大量鏈霉菌屬[6]和芽孢桿菌屬[7]等菌種的發酵產酶研究。相比其他來源的TGase,MTG具有非Ca2+依賴性、催化效率高、底物特異性低、溫度穩定性高[8]等特點,且其生產周期短,易分離純化,成本優勢明顯[9],故倍受研究者青睞。為提高MTG產率,國內外圍繞優勢菌種選育、發酵工藝優化及基因工程菌構建等方面展開了大量工作。目前,MTG已在大腸桿菌(Escherichiacoli)[10]、谷氨酸棒桿菌[11]、酵母[12]、枯草芽孢桿菌[13]和鏈霉菌等[14]宿主中成功表達,但普遍存在酶活低、產量少等問題。

本課題組在前期研究中將S.mobaraensis來源的TGase基因在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達。為探討以發酵法產MTG的可能性,本研究對重組大腸桿菌BL21(DE3)/mtg的發酵產酶過程進行了優化,為后續研究中試及工業化生產提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

含S.mobaraensisTGase基因的重組大腸桿菌BL21(DE3)/mtg由合肥工業大學食品科學與工程學院谷物科學與食品發酵研究室構建與保藏;CBZ-Gln-Gly、L-谷氨酸-γ-單羥肟酸均購自美國Sigma公司;還原性谷胱甘肽、Tris、牛血清蛋白均購自北京索萊寶科技有限公司;胰蛋白胨、酵母粉均購自英國Oxoid公司;卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)均購自生工生物工程(上海)股份有限公司;其他試劑均為國產分析純。

LDZX-50KBS型立式滅菌器上海申安醫療器械有限公司;ZHJH-C1112B型超凈工作臺、ZWY-240型全溫型多振幅軌道搖床上海智城分析儀器制造有限公司;DHP-9012B型電熱恒溫培養箱上海一恒科學儀器有限公司;SP-722E型可見分光光度計上海光譜儀器有限公司;HH-4型數顯恒溫水浴鍋江蘇省金壇市友聯儀器研究所;CR22GII型高速冷凍離心機日本Hitachi公司;PH-108型筆式酸度計杭州陸恒生物科技有限公司;JY99-IIIBN型超聲波連續流細胞粉碎機寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1培養基的配制種子培養基:LB/Kan培養基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10,卡那霉素0.1,pH7.0。發酵培養基:TB/Kan培養基(g/L):蛋白胨12,酵母粉24,K2HPO412.54,KH2PO42.31,甘油5,卡那霉素0.1,pH7.0。

1.2.2培養方法種子培養:自-80 ℃保藏的甘油管中取適量菌液涂布LB平板,37 ℃過夜培養后挑取單菌落接種于50 mL種子培養基(250 mL三角瓶),37 ℃、200 r/min過夜培養。發酵培養及誘導產酶:將培養好的種子液以5%的接種量接種到50 mL發酵培養基(250 mL三角瓶)中,37 ℃、200 r/min培養至菌液OD600為0.8時加入終濃度0.6 mmol/L的IPTG,26 ℃、200 r/min誘導16 h。

1.2.3單因素實驗以細胞密度值(OD600)及MTG比酶活為考察指標,依次以碳源種類(甘油、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉)、碳源濃度(2、4、5、6、8、10 g/L)、氮源種類(蛋白胨和酵母粉(1∶2)、氯化銨、硝酸鈉、硫酸銨、尿素)、氮源濃度(1、2、4、5、6、8 g/L)、接種量(1%、3%、5%、7%、9%)、裝液量(15、25、50、75、100 mL)(250 mL三角瓶)、培養溫度(26、30、34、37、41 ℃)、初始pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、IPTG濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)、誘導時機(IPTG添加時間:2、3、4、5、6、7 h)、誘導時間(13、14、15、16、17、18、19 h)及誘導溫度(22、26、30、34、37、41 ℃)為影響因素進行單因素實驗。初始實驗條件為:甘油5 g/L、蛋白胨12 g/L、酵母粉24 g/L、接種量5%、裝液量50 mL、培養溫度37 ℃、初始pH7.0、IPTG濃度0.6 mmol/L,誘導時機4 h、誘導時間16 h、誘導溫度26 ℃。除考察因素外,每次實驗的其他因素條件均以前一實驗所得最優條件置換。

1.2.4Plackett-Burman(PB)設計優化在單因素實驗基礎上進行PB設計,各因素選取2個水平,高水平約取低水平的1.25倍,響應值為MTG比酶活。PB實驗因素水平見表1。

表1　Plackett-Burman(PB)實驗因素水平設計

1.2.5Box-Benhnken(BB)實驗設計以PB實驗篩選出的三個顯著因素(培養溫度、初始pH、誘導溫度)為實驗因素,以MTG比酶活為響應值,各因素選取3個水平,設計三因素三水平共17個實驗點的響應面實驗。BB實驗因素水平設計見表2。

表2　Box-Benhnken(BB)實驗因素水平設計

1.2.6分析方法

1.2.6.1細胞密度值的測定發酵液經適度稀釋后,以無菌培養液為對照,于波長600 nm處所測吸光值乘以稀釋倍數即為菌體濃度(OD600)。

1.2.6.2MTG比酶活的測定發酵液4 ℃、7000 r/min離心10 min,收集菌體于冰上超聲破碎10 min,4 ℃、16000 r/min離心15 min,收集上清即為粗酶液。按Grossowicz比色法[15]測定酶活:以CBZ-Gln-Gly為底物,L-谷氨酸-γ-單羥肟酸作標準曲線。酶單位活力(U)定義為:37 ℃時每分鐘催化底物生成 1 μmol L-谷氨酸-γ-單羥肟酸的酶量。比酶活(U/mg)定義為:每毫克蛋白具有的酶活力。蛋白含量測定參考Bradford法[16]。

1.3數據處理

每組實驗均重復三次,實驗結果以平均值±標準差形式表示。應用Microsoft Office Excel 2013和Design-Expert 8.0.6軟件進行數據分析,Origin 8.5軟件作圖。

2　結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1碳源種類及濃度對重組菌生長和產酶的影響碳源為微生物生長代謝提供物質基礎和能量來源。按含碳質量分數相等的原則,分別以葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖和可溶性淀粉來代替TB培養基中的甘油(5 g/L)為碳源進行單因素實驗。由圖1可知,碳源為可溶性淀粉時菌體濃度最高,但MTG比酶活較低;葡萄糖為碳源時MTG比酶活最高,且菌體濃度僅次于淀粉。故選擇葡萄糖為最優碳源,進而考察其濃度對菌體生長和產酶的影響。由圖2可知,隨著葡萄糖濃度的增加,菌體濃度和MTG比酶活均先增加后減少,當葡萄糖濃度為5 g/L時,兩者均達最高值,分別為(4.49±0.46)和(1.13±0.08)U/mg。黃亞杰等[17]也有類似報道。

圖1　不同碳源對菌體生長和產酶的影響Fig.1　Effect of different carbon sources on cell growth and MTG production

圖2　葡萄糖濃度對菌體生長和產酶的影響Fig.2　Effect of glucose concentrations on cell growth and MTG production

2.1.2氮源種類及濃度對重組菌生長和產酶的影響氮源主要用于菌體細胞物質和含氮代謝物的合成。按含氮質量分數相等的原則,分別以氯化銨、硝酸鈉、硫酸銨和尿素來代替TB培養基中的復合氮源(總含氮量為4.2 g/L)進行單因素實驗。由圖3可知,氮源種類對重組菌生長和產酶有較大影響,復合氮源明顯優于其他氮源。據Harrison等[18]研究顯示,酵母粉對重組酶釋放至大腸桿菌周質空間有明顯促進作用。故保持蛋白胨和酵母粉復配比不變,進而考察復合氮源總含氮量對重組菌生長和產酶的影響。由圖4可知,隨氮源濃度的增加,菌體濃度也增加,而MTG比酶活呈先增后減趨勢。當復配氮源總含氮量為5 g/L(蛋白胨為14 g/L,酵母粉為28 g/L)時,MTG比酶活達最大值,為(1.17±0.09)U/mg。

圖3　不同氮源對菌體生長和產酶的影響Fig.3　Effect of different nitrogen sources on cell growth and MTG production

圖4　氮源濃度對菌體生長和產酶的影響Fig.4　Effect of nitrogen concentrations on cell growth and MTG production

2.1.3接種量對重組菌生長和產酶的影響接種量對發酵周期及溶氧量都有直接影響[17]。由圖5可知,當接種量為5%時,菌體濃度和MTG比酶活均最大。故選擇5%為最佳接種量。

2.1.4裝液量對重組菌生長和產酶的影響裝液量影響菌株通氣狀況,適度的溶解氧是微生物代謝及產物合成的關鍵。由圖6可知,隨裝液量的增加,菌體濃度和MTG的比酶活均上升,在50 mL時達到最大值,隨后均降低。故選擇50 mL為最佳裝液量。

圖5　接種量對菌體生長和產酶的影響Fig.5　Effect of inoculum sizes on cell growth and MTG production

圖6　裝液量對菌體生長和產酶的影響Fig.6　Effect of medium volumes on cell growth and MTG production

圖7　培養溫度對菌體生長和產酶的影響Fig.7　Effect of temperatures on cell growth and MTG production

2.1.5培養溫度對重組菌生長和產酶的影響較高溫度時細菌生長速率高,但易積累代謝副產物,抑制其生長和產物表達[19]。由圖7可知,37 ℃時菌體濃度最高,但34 ℃時MTG比酶活最高(1.32±0.16)U/mg,為前者的1.3倍。故選擇34 ℃為最佳培養溫度。

2.1.6初始pH對重組菌生長和產酶的影響由圖8可知,pH對菌體生長和產酶有較大影響。隨其增加,菌體濃度和MTG比酶活均先上升后下降,pH為7.0時,兩者都為最大值。故選擇pH7.0為最佳初始pH。

圖8　初始pH對菌體生長和產酶的影響Fig.8　Effect of initial pH on cell growth and MTG production

2.1.7IPTG濃度對重組菌生長和產酶的影響由圖9可知,IPTG濃度為0.6 mmol/L時,MTG比酶活最高,為(1.32±0.14)U/mg。故選擇0.6 mmol/L為最佳IPTG濃度。

圖9　IPTG濃度對菌體生長和產酶的影響Fig.9　Effect of IPTG concentrations on cell growth and MTG production

2.1.8誘導時機(IPTG添加時間)對重組菌生長和產酶的影響由圖10可知,在對數中期4 h添加IPTG,MTG比酶活最高,這與之前類似研究報道[20]一致。故選擇4 h為最佳誘導時機。

圖10　IPTG添加時間對菌體生長和產酶的影響Fig.10　Effect of the adding time of IPTG on cell growth and MTG production

圖11　誘導時間對菌體生長和產酶的影響Fig.11　Effect of induction time on cell growth and MTG production

2.1.9誘導時間對重組菌生長和產酶的影響由圖11可知,14 h時菌體濃度和MTG比酶活均為最高值,此后隨時間增加而降低。故選擇14 h為最佳誘導時間。

表3　PB實驗設計及結果

2.1.10誘導溫度對重組菌生長和產酶的影響由圖12可知,22～37 ℃內菌體濃度隨誘導溫度增加而增加,但低溫有利于重組大腸桿菌產物的表達[19],26 ℃時MTG的比酶活最高,故選擇26 ℃為最佳誘導溫度。

圖12　誘導溫度對菌體生長和產酶的影響Fig.12　Effect of induction temperatures on cell growth and MTG production

2.2PB實驗

PB設計及實驗結果見表3,方差分析見表4。模型p<0.05(0.0463),顯著可用。由表4可知,MTG比酶活的顯著影響因素依次為初始pH、培養溫度、誘導溫度,其他因素對MTG比酶活影響較小。因此選擇以上三個因素進行響應面優化。

表4　PB設計方差分析

注:*表示差異顯著(p<0.05);**表示差異極顯著(p<0.01),表6同。

2.3BB實驗

2.3.1BB設計及結果分析響應面實驗設計及結果見表5,利用Design-Expert軟件對表5數據進行回歸擬合所得方程為:

Y=1.5+0.013A+0.035B-0.093C+0.075AB-0.028AC+0.019BC-0.21A2-0.54B2-0.18C2。

回歸方程相關系數R2為0.993,說明方程擬合較好,可用來分析各因素和MTG比酶活間的關系。由表6可知,回歸模型極顯著(p<0.0001),失擬項不顯著(p>0.05),模型可用。對MTG比酶活影響最顯著的因素為誘導溫度(C),其次為初始pH(B)和培養溫度(A)。除培養溫度、初始pH與誘導溫度交互項(BC)為顯著因素外,各因素及其交互作用(B、C、AB、AC、A2、B2、C2)都為極顯著性因素。

表5　BB實驗設計及結果

表6　BB設計方差分析

2.3.2各因素間的交互作用初始pH與培養溫度、初始pH與誘導溫度、培養溫度與誘導溫度的交互作用對MTG比酶活影響的響應面圖見圖13。由圖可知,響應面陡峭,各因素間交互作用明顯。經軟件分析計算得當培養溫度為33.68 ℃、初始pH為7.02、誘導溫度為24.98 ℃時,MTG比酶活的預測值最大,為1.511 U/mg。

圖13　各因素交互作用對MTG比酶活的交互影響Fig.13　Response surface plots of variable parameters on the specific activity of MTG

2.3.3驗證實驗考慮實際操作的局限性,將上述預測最優條件修正為:培養溫度34 ℃、初始pH7.0、誘導溫度25 ℃。該條件下所產MTG比酶活為(1.507±0.03)U/mg,與理論值接近,且在95%預測區間[1.44,1.59]內,說明通過響應面分析得到的條件較為可靠,具有一定的實踐指導意義。

3　結論

通過單因素實驗、Plackett-Burnman設計及Box-Benhnken設計,對重組大腸桿菌產MTG的發酵條件進行了優化。結果表明,最佳發酵條件為:葡萄糖5 g/L,酵母粉28 g/L,蛋白胨14 g/L,接種量5%,裝液量50 mL(250 mL三角瓶),初始pH7.0,培養溫度34 ℃,誘導時機4 h,IPTG濃度0.6 mmol/L,誘導溫度25 ℃,誘導時間14 h。優化后的MTG比酶活為1.507 U/mg,為未優化前的1.56倍。

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Optimization of the fermentation conditions for transglutaminase by recombinantEscherichiacoli

SHU Chang1,LUO Shui-zhong1,2,CAI Jing1,2,JIANG Shao-tong1,2,ZHENG Zhi1,2,*

(1.School of Food Science and Engineering,Hefei 230009,China;2.Key Laboratory for Agricultural Products Processing of Anhui Province,Hefei 230009,China)

The paper investigated the improvement of the production of microbial transglutaminase(MTGase,MTG)by recombinantEscherichiacoliBL21(DE3)/mtg in 250 mL shake flasks. Using single factor experiment,the types and the concentrations of carbon sources and nitrogen sources of the media,the inoculum sizes,the medium volumes,the culture temperature,the initial pH,the inducer concentration,the adding time of inducer,the induction temperature and the induction time were optimized,respectively. Among the above factors,3 key factors,the culture temperature,the initial pH and the induction temperature,were selected by Plackett-Burman design. And a response surface model of the 3 factors and the specific activity of MTG were constructed by Box-Benhnken design. The optimal conditions were as follows,the media contained 5 g/L of glucose,28 g/L of yeast extract and 14 g/L of tryptone,and the bacteria were cultured in 50 mL(250 mL triangle bottle),pH7.0 optimized media at 34 ℃ for 4 h with 5%(v/v)inocula and were induced by 0.6 mmol/L IPTG at 25 ℃ for 14 h. Under the optimal conditions,the maximum specific activity of MTG was 1.507 U/mg,which was 1.56 times larger than the MTG produced in initial conditions.

transglutaminase;recombinantEscherichiacoli;fermentation optimization;response surface method

2016-01-04

舒暢(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：發酵工程，E-mail：allison_shu@163.com。

鄭志(1971-)，男，博士，教授，研究方向：谷物科學，E-mail：zhengzhi@hfut.edu.cn。

國家高技術研究發展計劃(863計劃)(2013AA102201)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)12-0183-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.027