戊二胺高通量檢測方法的研究

張　弘,馬偉超,陳可泉

(南京工業大學生物與制藥工程學院,江蘇南京 211816)

?

戊二胺高通量檢測方法的研究

張弘,馬偉超,陳可泉*

(南京工業大學生物與制藥工程學院,江蘇南京 211816)

本文以全細胞催化法制備的1,5-戊二胺轉化液為檢測對象,通過對萃取劑、反應溫度和時間進行優化,建立了一種基于分光光度法的高通量生物胺檢測方法。結果表明,使用對二甲苯為萃取劑更有利于排除底物L-賴氨酸的影響,1,5-戊二胺與2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)衍生反應的最佳條件為42 ℃,反應6 min。應用該方法建立的標準曲線線性關系良好,相關系數R2為0.9988,線性范圍為4.176～20.88 μg。方法學研究表明本方法有較好的精確度(RSD=1.722%)與重現性(RSD=6.414%),其加標回收率為100.5%。本方法操作簡單,省時,適用于生物胺的常規快速定量檢測。

生物胺,分光光度法,高通量檢測

生物胺是一類堿性含氮、具有生物活性的小分子有機物的總稱,包括尸胺、組胺、多巴胺等,廣泛存在于生物體中,具有重要的生理作用[1],其含量的高低可作為疾病診斷[2]或食品檢驗[3]的指標。此外,生物胺中的尸胺(1,5-戊二胺)可作為尼龍單體與丁二酸、癸二酸等聚合生成PA5.4、PA5.10等生物尼龍[4],特別是近期利用全細胞轉化法生產1,5-戊二胺的研究,使其產量較發酵法有大幅度的提升,具有廣闊的工業化前景[5-6]。生物胺的快速、高通量檢測在食品安全、疾病診斷以及工業化生產中都具有重要的意義,目前常用的檢測方法中液相色譜應用較廣泛,回收率可控制在83%～116%[7],但需要對樣品進行衍生化處理,過程復雜,耗時較長,樣品衍生及檢測耗時約1.5 h[8];氣相色譜法需要對樣品進行預處理,不同生物胺的檢測方法通用性較差,且準確性相對較差,部分樣品回收率可控制在74%～115%[9];而薄層色譜操作簡單,成本低廉,但其通用性較差,且耗時較長,檢測全程需1～1.5 h,部分樣品回收率可控制在85%～92%[10]。因而都無法滿足高通量檢測的要求。由于生物胺可以與顯色劑TNBS反應,且具有特定的紫外吸收峰[11],因而可應用這一特性,利用分光光度法實現生物胺的高通量定量檢測。本文利用分光光度法,以全細胞催化法獲得的1,5-戊二胺轉化液為研究對象,建立了一種1,5-戊二胺的高通量檢測方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

戊二胺梯希愛(上海)化成工業發展有限公司;5%(w/v)2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)Sigma公司;L-賴氨酸鹽酸鹽生工生物工程上海(股份)有限公司;其它試劑均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

Multiskan GO全波長酶標儀美國賽默飛世爾科技公司;GZX-9140 MBE型電熱鼓風干燥箱上海博訊實業有限公司醫療設備廠;UV-star 96孔板德國Greiner Bio-one公司;96孔深孔板生工生物工程上海(股份)有限公司;MS 3數顯混勻器德國IKA集團;Multipette M4分液器德國Eppendorf公司。

1.2實驗方法

1.2.1溶液的配制標準溶液的配制:分別稱取0.1044 g 1,5-戊二胺和0.1100 gL-賴氨酸,配制濃度為20.88 g/L的1,5-戊二胺溶液和22.00 g/L的L-賴氨酸溶液,再將其分別稀釋100倍,配制2.088 g/L的1,5-戊二胺標準溶液和2.200 g/L L-賴氨酸標準溶液。10 mol/L TNBS溶液的配制:取5%(w/v)TNBS 294 μL,用超純水定容于5 mL容量瓶中。

1.2.21,5-戊二胺樣品的制備利用全細胞轉化法制備1,5-戊二胺樣品[5],經HPLC法檢測,確定其1,5-戊二胺濃度為2.667 g/L。

1.2.31,5-戊二胺的測定取5 μL的樣品,用水補充至50 μL,與50 μL的1 mol/L NaCO3和50 μL的10 mmol/L TNBS在一定溫度下反應一定時間;取100 μL冷卻后的反應混合物至96孔深孔板中,加入500 μL的甲苯(或對二甲苯)震蕩萃取2 min后室溫靜置分相3 min;分別吸取100 μL上層萃取液和100 μL無水乙醇至UV-star 96孔板中進行混合,利用酶標儀在340 nm下測其吸光度。

1.2.4底物賴氨酸對檢測的影響為檢驗剩余的底物L-賴氨酸對1,5-戊二胺檢測的影響,分別制備兩組實驗樣品,其中樣品1為含10.44 μg戊二胺的水溶液;樣品2包含10.44 μg 1,5-戊二胺及11.00 μg L-賴氨酸。將兩份樣品按方法1.2.3進行檢測(反應溫度為42 ℃,反應時間為6 min),分別用甲苯和對二甲苯進行萃取,用酶標儀測其吸光值。

1.2.5反應條件優化反應溫度優化:按1.2.3的方法檢測1,5-戊二胺在34、38、42、44、46 ℃條件下與TNBS反應6 min后的吸光值變化。反應時間優化:按1.2.3的方法檢測1,5-戊二胺在優化后的溫度下與TNBS分別反應2、4、6、8、10 min后的吸光值變化。

1.2.61,5-戊二胺標準曲線的建立分別取質量為4.176、8.352、12.528、16.704、20.88 μg的1,5-戊二胺,按1.2.5所確定的方法對各樣品的吸光度進行檢測,繪制出吸光度-戊二胺質量標準曲線。

2　結果與分析

2.1底物賴氨酸對檢測的影響

由于底物L-賴氨酸也可與TNBS反應,其生成的N,N′-雙三硝基苯酰賴氨酸(TNP-lysine)在340 nm下也具有紫外吸收[11],但由于TNP-lysine主要溶于水相,而TNBS與1,5-戊二胺的衍生產物N,N′-雙三硝基苯酰戊二胺(TNP-cadaverine)溶于有機相,因而通過選擇適宜的有機萃取劑,可有效排除底物L-賴氨酸對檢測的影響。本實驗對比了甲苯和對二甲苯作為萃取劑對檢測的影響,結果如圖1所示。用甲苯作為萃取劑時,樣品1(1,5-戊二胺)和樣品2(1,5-戊二胺+L-賴氨酸)的吸光值具有顯著差異(p<0.05),而用對二甲苯作為萃取劑時,樣品1和樣品2的吸光值沒有顯著差異(p>0.05),說明使用對二甲苯作為萃取劑可以有效排除L-賴氨酸對檢測的干擾。

圖1　賴氨酸對檢測的影響Fig.1　The influence of lysine on the determination of cadaverine

2.2最佳反應溫度的確定

在衍生化反應中,溫度具有重要影響,其過低或過高都會影響分析效果[12]。本實驗取1,5-戊二胺標準溶液5 μL(含1,5-戊二胺10.44 μg),按1.2.3的方法檢測在34、38、42、44、46 ℃條件下反應6 min后的吸光值變化。結果表明,在42 ℃下反應物的吸光值最高(如圖2所示),說明在42 ℃時1,5-戊二胺與TNBS反應較充分,且形成的絡合物也最穩定,因此本方法采用的反應溫度為42 ℃。

圖2　反應溫度的優化Fig.2　The optimization of reaction temperature

2.3最佳反應時間的確定

TNBS與1,5-戊二胺反應時間過短,反應無法充分進行,若反應時間過長,不僅降低實驗效率,而且還可能會對產物穩定性產生影響[11]。本實驗取1,5-戊二胺標準溶液5 μL(含1,5-戊二胺10.44 μg),按1.2.3的方法在42 ℃分別反應2、4、6、8、10 min。結果表明,反應6 min時反應物的吸光值達到最大值(如圖3所示),說明反應6 min時,1,5-戊二胺與TNBS反應比較充分,反應產物也比較穩定。因此本方法采用的反應時間為6 min。

表1　精密度實驗Table 1　Results of precision tests

表2　重現性實驗Table 2　Results of reproducibility tests

圖3　反應時間的優化Fig.3　The optimization of reaction time

2.41,5-戊二胺標準曲線的建立

以1.2.3中的方法為基礎,反應溫度定為42 ℃,反應時間定為6 min,建立最終的檢測方法。運用該方法測定不同質量的戊二胺,結果表明,1,5-戊二胺質量與吸光度具有良好的線性關系,相關系數R2為0.9988,方程為:Y=0.04035X-0.0681,線性范圍為4.176～20.88 μg(如圖4所示)。

圖4　1,5-戊二胺的標準曲線Fig.4　Standard curve of Cadaverine

2.5方法學考察

2.5.1精密度實驗取6 μL全細胞轉化液樣品,按1.2.5所確定的方法進行檢測,連續測量6次[13],結果顯示精密度實驗相對標準偏差(RSD)為1.722%(如表1所示),表明該方法具有良好的精密度。

2.5.2重現性實驗同一批次6份樣品各取3 μL測量其1,5-戊二胺含量,進行方法的重現性考察[13]。結果表明,重現性相對標準偏差(RSD)為6.414%(如表2所示),表明該方法具有較好的重現性。

2.5.3加標回收率實驗取全細胞轉化液樣品5 μL,向其中加入5 μg 1,5-戊二胺標品,按1.2.5的方法進行檢測,連續測量5次,每次測量3個平行樣,計算其回收率[14-15]。結果表明,各組的回收率均在95%～105%范圍內,平均回收率為100.5%,顯示該方法具有較高的準確性(如表3所示)。

表3　回收率實驗Table 3　Results of recovery tests

3　結論

本文通過對萃取劑的選擇、反應溫度和反應時間的優化,建立了一種快速、高通量檢測1,5-戊二胺的方法,且有較好的重現性和準確度。在本方法中,最佳反應溫度為42 ℃,最佳反應時間為6 min,采用對二甲苯為萃取劑可以有效排除底物L-賴氨酸對檢測的影響。吸光度-1,5-戊二胺質量標準曲線的相關系數R2為0.9988,線性范圍為4.176～20.88 μg。此外,由于使用了高通量檢測儀器,檢測效率明顯提高,在實際應用中,該方法可以用于全細胞轉化液等組分比較單一的樣品的定性、定量分析,也可用于食品安全等領域的生物胺初步、快速檢測。

[1]王穎,邱璠,韓北忠,等. 食品中的生物胺及其檢測方法[J].中國釀造,2011(10):1-4.

[2]吳勤學.5-羥色胺在皮膚病中的意義[J]. 國外醫學參考資料. 皮膚病學分冊,1975(1):24-26.

[3]劉辰麒,丁卓平,王錫昌. 生物胺的檢測方法評價[J]. 現代科學儀器,2006(4):89-91.

[4]Kind S,Neubauer S,Becker J,et al. From zero to hero - Pr oduction of bio-based nylon from renewable resources using engineeredCorynebacteriumglutamicum[J]. Metabolic Engineering,2014(25):113-123.

[5]Ma WC,Cao WJ,Zhang H,et al. Enhanced cadaverine production from L-lysine using recombinantEscherichiacolico-overexpressing CadA and CadB[J]. Biotechnology Letters,2015,37(4):799-806.

[6]Li NQ,Chou HW,Yu LJ,et al. Cadaverine production by heterologous expression ofKlebsiellaoxytocalysine decarboxylase[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering,2014,19(6):965-972.

[7]Proestos C,Loukatos P,Komaitis M. Determination of biogenic amines in wines by HPLC with precolumn dansylation and fluorimetric detection[J]. Food Chemistry,2008,106(3):1218-1224.

[8]Lorenzo JM,Cachaldora A,Fonseca S,et al. Production of biogenic amines “invitro” in relation to the growth phase byEnterobacteriaceaespecies isolated from traditional sausages[J]. Meat Science,2010,86(3):684-691.

[9]Fernandes JO,Ferreir MA. Combined ion-pair extraction and gas chromatography-mass spectrometry for the simultaneous determination of diamines,polyamines and aromatic amines in Port wine and grape juice[J]. Journal of Chromatography A,2000,886(1-2):183-195.

[10]Shalaby AR. Simple,rapid and valid thin layer chromatographic method for determining biogenic amines in foods[J]. Food Chemistry,1999,65(1):117-121.

[11]Phan APH,Ngo TT,Lenhoff HM. Spectrophotometric Assay for Lysine Decarboxylase[J]. Analytical Biochemistry,1982,120:193-197.

[12]劉洪濤,吳洪,曹永兵,等. 衍生化-毛細管氣相色譜法定量分析白念珠菌中甾醇含量[J]. 藥物分析雜志,2002(10):264-267.

[13]高虹,周楊,孫遠明,等. HPLC法檢測細胞培養上清液中前列腺素E2的含量[J]. 食品工業科技,2012(1):326-328.

[14]伍云卿,涂杰峰,范超,等. 加標回收實驗方案探討[J]. 福建分析測試,2010,19(3):67-71.

[15]張虹. 加標回收率的測定和結果判斷[J]. 石油與天然氣化工,2000(1):50-52.

Study on the high-throughput detection of cadaverine

ZHANG Hong,MA Wei-chao,CHEN Ke-quan*

(Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing 211816,China)

In this paper,to develop a high-throughput bioamine detection method based on spectrophotometry,the cadaverine concentration in a whole-cell bioconversion solution was determined,and the extracting agent,reaction temperature and time were optimized. The results showed that the use of p-xylene as the extraction agent was more conducive to eliminate the influence of theL-lysine on bioamine detection,and the optimal conditions for the derivatization of cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS)were 42 ℃ and 6 min. By using this method,a standard curve with a correlation coefficient(R2)of 0.9988 was obtained,and the linear range was 4.176～20.88 μg. The results of validation studies showed that,this method was precise(RSD=1.722%)and reproducible(RSD=6.414%),and the recovery was 100.5%. This method was simple,time-saving and suitable for the conventional rapid quantitative detecting of biogenic amines.

cadaverine;spectrophotometry;high-throughput detection

2015-08-27

陳可泉(1982-)，男，博士，副教授，研究方向：生物催化工程,E-mail:kqchen@njtech.edu.cn。

張弘(1989-)，男，在讀碩士研究生，研究方向：分子生物學與發酵工程,E-mail:zh644705227@hotmail.com。

國家自然科學基金(21390200);國家自然科學基金(31440024)；“973”計劃(2011CBA00807)；“863”計劃(2014AA021703)。

TS207.7

A

1002-0306(2016)05-0283-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.048