噴霧干燥法制備牡蠣肽粉的體內抗氧化活性研究

許　旻,朱良松,熊何健,蘇　捷,劉淑集,劉智禹,*

(1.福建省水產研究所,國家海水魚類加工技術研發分中心(廈門),福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室,福建省海洋生物資源開發利用協同創新中心,福建廈門 361013;2.集美大學,福建廈門 361021;3.杭州丘比食品有限公司,浙江杭州 310018)

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噴霧干燥法制備牡蠣肽粉的體內抗氧化活性研究

許旻1,朱良松2,3,熊何健2,蘇捷1,劉淑集1,劉智禹1,*

(1.福建省水產研究所,國家海水魚類加工技術研發分中心(廈門),福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室,福建省海洋生物資源開發利用協同創新中心,福建廈門 361013;2.集美大學,福建廈門 361021;3.杭州丘比食品有限公司,浙江杭州 310018)

研究噴霧干燥制備牡蠣肽粉對體內抗氧化活性的影響。以新鮮葡萄牙牡蠣為原料,通過選擇性復合酶解后噴霧干燥制備牡蠣肽粉,分別測定小鼠丙二醛(MDA)、蛋白質羰基、超氧化物歧化酶(SOD)和還原型谷胱甘肽(GSH)含量等指標考察牡蠣肽粉對小鼠抗氧化活性的影響。結果顯示,與模型對照組相比,經過噴霧干燥后的牡蠣肽粉不同劑量組均可極顯著地降低小鼠血清丙二醛含量和蛋白質羰基含量(p<0.01),并顯著提高超氧化物歧化酶和還原型谷胱甘肽的含量(p<0.01)。結果表明噴霧干燥制備的牡蠣肽粉具有良好的體內抗氧化作用。

牡蠣,多肽,噴霧干燥,抗氧化

氧化衰老一直以來都是人們關注的健康問題。機體在生命過程中時刻都在產生自由基,如果自由基產生過多或者清除過慢,不斷地積累,就會攻擊細胞器和生命大分子物質,加速機體損傷并引發各種疾病[1]。機體通過酶抗氧化劑或非酶抗氧化劑等防御系統可消化和清除自由基的產生。隨著科學的進步,科學家越來越多的使用外源性抗氧化劑達到抗氧化目的。尤其是最近幾十年,從植物、動物中提取具有顯著地抗氧化活性的多酚[2]、黃酮[3]、多肽[4]等天然產物,廣泛用于食品添加劑、藥品和保健食品的生產。

表1　牡蠣肽粉對小鼠體重的影響Table 1　The effects of Oyster peptide on body weight of mice

牡蠣是一種營養價值較高的海洋貝類,含有豐富的蛋白質、脂肪、維生素及微量元素[5]。牡蠣中提取的生物活性肽在降壓、抗腫瘤、抗氧化等方面有顯著的活性[6-8]。但是目前國內外研究主要集中在牡蠣酶解液的體內抗氧化活性[6,8-15],而對加工條件及其抗氧化活性影響卻鮮有報道,由于多肽中的氨基酸組成復雜,這使得其在生產、應用和儲存過程中發生氧化、降解等作用影響肽的穩定性,甚至有可能導致活性完全喪失[16]。因此本實驗根據實際生產情況,利用噴霧干燥制得牡蠣肽粉成品,但由于短時間高溫可能會造成蛋白活性發生變化,因此本文探討噴霧干燥粉末對小鼠體內抗氧化能力的影響,為開發具有抗氧化活性的保健產品提供依據,為后續研究噴霧干燥制得牡蠣肽粉對其他活性機理的影響奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮葡萄牙牡蠣廈門第八市場;胰蛋白酶(2.5×105U/g)，風味蛋白酶(1.5×104U/g)南寧龐博生物工程有限公司；SPF級雄性ICR小鼠200只,18～22 g上海斯萊克實驗動物有限責任公司;小鼠飼料北京華阜康生物科技股份有限公司,生產許可證號:SCXK(京)2009-0008京飼審(2009)06170。

丙二醛測定試劑盒、蛋白質羰基測定試劑盒、超氧化物歧化酶測定試劑盒、還原型谷胱甘肽測定試劑盒、考馬斯亮藍測定試劑盒南京建成科技有限公司。

S10組織勻漿機寧波新芝生物;HH-6型恒溫水浴鍋國華電器有限公司;陶瓷膜機組、超濾膜機組(截留分子量5 ku)、納濾膜機組(卷式納濾膜,最小截留分子量150)世達膜科技(廈門)有限公司;YS-ZS-420真空包裝機杭州永創智能設備股份有限公司;XF0.3-2型噴霧干燥器常州市新業制粒干燥設備有限公司;Cintra6型紫外可見分光光度計澳大利亞科學儀器設備有限公司;Centrifuge 5804 R型高速冷凍離心機德國Eppendorf公司;XH-D漩渦混勻器上海比朗儀器制造有限公司;BS4202S電子分析天平德國賽多利斯集團。

1.2實驗方法

1.2.1牡蠣勻漿的制備將新鮮牡蠣清洗瀝干后打漿,烘干成粉末。

1.2.2牡蠣肽粉的制備將新鮮牡蠣清洗瀝干后打漿→按1∶2的比例加水→加酶量胰蛋白酶7500 U/g、風味蛋白酶450 U/g→溫度50 ℃、pH8.0、時間4 h→離心取上清→陶瓷膜除雜→超濾膜過濾獲得小于5 ku分子量的多肽→納濾膜濃縮至固形物含量達10%→噴霧干燥(進風溫度180 ℃,出風溫度80 ℃)→得到牡蠣活性肽粉→真空包裝低溫保存。

1.2.3動物分組及給藥方法SPF級雄性ICR小鼠60只,18～22 g,適應性喂養一周,隨機分為6組,每組10只。分別為:空白對照組(0.5 mL生理鹽水)、模型對照組(0.5 mL生理鹽水)、牡蠣勻漿組(2.0 g/kg·BW牡蠣勻漿)、牡蠣肽粉低劑量組(0.5 g/kg·BW牡蠣肽粉)、牡蠣肽粉中劑量組(1.0 g/kg·BW牡蠣肽粉)、牡蠣肽粉高劑量組(2.0 g/kg·BW牡蠣肽粉)。同時飼喂小鼠維持飼料,自由飲水,連續喂養30 d,末次灌胃后,模型對照組、牡蠣勻漿組和牡蠣肽粉低劑量組、中劑量組、高劑量組分別禁食過夜16 h,然后灌胃50%乙醇12 mL/kg·BW,6 h后拔眼球取血和肝臟。血液放置于4 ℃冰箱過夜沉降,4000 r/min離心分離后取血清;取肝臟經生理鹽水漂洗后濾紙吸干,加入生理鹽水在冰水浴下勻漿,離心取上清備用[17]。

1.2.4指標測定按照試劑盒指定方法測定丙二醛(MDA)、蛋白質羰基含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力以及還原性谷胱甘肽(GSH)含量。

2　結果與討論

2.1牡蠣肽粉對小鼠體重的影響

表1表明,各組小鼠體重在實驗前、后組間無顯著性差異(p>0.05),不具有統計學意義。說明牡蠣肽粉對小鼠的生長發育和一般健康情況無不良影響。

2.2牡蠣肽粉對小鼠丙二醛含量的影響

表2　牡蠣肽粉對小鼠血清丙二醛含量的影響Table 2　The effected of Oyster peptide on serum MDA in mice

注:“*”與空白對照組比,p<0.05;“**”與空白對照組比,p<0.01;“#”與模型對照組比,p<0.05;“##”與模型對照組比,p<0.01，表3～表5同。

表3　牡蠣肽粉對小鼠血清SOD活力的影響Table 3　The effects of Oyster peptide on serum SOD activity in mice

表4　牡蠣肽粉對小鼠蛋白質羰基含量的影響Table 4　The effects of Oyster peptide on protein carbonyl in mice

表5　牡蠣肽粉對小鼠GSH含量的影響Table 5　The effects of Oyster peptide on GSH in mice

丙二醛是脂質過氧化過程中產生的活性羰基類物質,其含量高低可以反映機體脂質過氧化水平,在一定程度上間接反映機體受自由基攻擊的嚴重程度。

表2可以看出,與空白對照組相比,模型對照組小鼠血清中的丙二醛含量極顯著增加(p<0.01),說明小鼠氧化衰老模型建立成功。與模型對照組相比,牡蠣勻漿組和牡蠣肽粉低、中、高三個劑量組的血清丙二醛含量都極顯著降低(p<0.01),說明牡蠣勻漿組和牡蠣肽粉都能有效地降低小鼠血清丙二醛含量。隨著牡蠣肽粉劑量的增加,丙二醛的含量呈現遞減的趨勢,可以看出小鼠血清丙二醛含量與牡蠣肽粉劑量具有相關性。與空白對照組相比,牡蠣肽粉高劑量組顯著降低(p<0.01)。結果說明噴霧干燥后的牡蠣肽粉可以降低小鼠體內丙二醛含量,具有突出的修復機體衰老損傷的治療效力。

2.3牡蠣肽粉對小鼠超氧化物歧化酶活力的影響

從表3可以看出,與空白對照組相比,模型對照組小鼠血清SOD活力極顯著降低(p<0.01),說明造模成功。與模型對照組相比,牡蠣勻漿組和牡蠣肽粉低、中、高三個劑量組均能極顯著提高小鼠SOD活力(p<0.01),并且SOD活力與牡蠣肽粉劑量具有相關性。但與正常組相比,還有明顯的差距(p<0.01)。結果說明噴霧干燥后的牡蠣肽粉對小鼠的急性氧化損傷具有良好的預防作用,但不具備修復SOD活力降低的作用。

2.4牡蠣肽粉對小鼠蛋白質羰基含量的影響

蛋白質羰基化是指氨基酸殘基側鏈中的氨基或亞氨基受到氧自由基攻擊最后轉變成醛基,并釋放NH3+的過程。測定蛋白的羰基化水平是評價蛋白質總氧化水平的常用方法。

表4蛋白質羰基含量測定結果顯示,與空白對照組相比,模型對照組的小鼠肝臟蛋白質羰基含量有極顯著的增加(p<0.01),說明造模成功。與模型對照組相比,牡蠣勻漿組和牡蠣肽粉低、中、高劑量組的蛋白質羰基含量都極顯著降低(p<0.01),可以看出牡蠣勻漿和牡蠣肽粉都可以抑制蛋白質氧化,降低蛋白質羰基的含量。牡蠣肽粉的效果要明顯優于牡蠣勻漿粉,并呈劑量依賴性。上述結果表明,噴霧干燥后的牡蠣肽粉能夠減少蛋白羰基化合物的形成,提高小鼠抗氧化損傷的能力。

2.5牡蠣肽粉對小鼠還原型谷胱甘肽含量的影響

谷胱甘肽是一種低分子清除劑,它可清除O2-、H2O2、LOOH,是GSH-PX和GST兩種酶類的底物,為這2種酶分解氫過氧化物所必需,它能穩定含巰基的酶,和防止血紅蛋白及其它輔助因子受氧化損傷,GSH量的多少是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素。

表5表明,與空白對照組相比,模型對照組小鼠肝臟GSH含量極顯著降低(p<0.01)。與模型對照組相比,牡蠣肽粉高劑量組的GSH含量有極顯著的增加(p<0.01),但與空白對照組相比沒有顯著性差異。機體代謝過程中產生的過量自由基會損傷生物膜、侵襲生物大分子物質、促進機體衰老等一系列不良反應的發生,GSH具有清除自由基的能力,表5中高劑量的牡蠣肽粉可以極顯著的提高小鼠GSH含量,可見高劑量組的牡蠣肽粉具有突出的修復機體衰老損傷的治療效力。

3　結論

本研究用復合酶解后噴霧干燥制備牡蠣肽粉,通過對小鼠生化指標的測定噴霧干燥的牡蠣肽粉對小鼠體內抗氧化的活性作用。結果表明,噴霧干燥制備的牡蠣肽粉對降低小鼠MDA和蛋白質羰基含量、增加SOD活力和GSH含量等方面均具有顯著效果,具有很好的抗氧化效果。可能是噴霧干燥過程中,提取液被霧化為體積極小的液滴,在熱氣流充分接觸的極短時間內迅速蒸發水分,帶走了液滴中大量的熱量,肽粉實際受熱較低,受熱時間短,因此熱敏成分破壞少。

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Preparation andinvivoantioxidant activity of spray-dried peptides fromCrassostreaangulate

XU Min1,ZHU Liang-song2,3,XIONG He-jian2,SU Jie1,LIU Shu-ji1,LIU Zhi-yu1,*

(1. Fisheries Research Institute of Fujian,National Research and Development Center for Marine Fish Processing(Xiamen),Key Laboratory of Cutivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province,Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources,Xiamen 361013,China;2. Jimei University,Xiamen 361021,China;3. Hangzhou kewpie Corporation,Hangzhou 310018,China)

The preparation andinvivoantioxidant activity of peptides from the protein hydrolysate of oysters were investigated. FreshCrassostreaangulatawere hydrolyzed by a commercial mixture of proteases and spray-dried method to produce oyster peptides. The levels of malondialdehyde(MDA),protein carbonyls(PC)as well as the activities of superoxide dismutase(SOD)and glutathione(GSH)were evaluated for their antioxidant activity of oysters peptides. The results showed that MDA and PC levels in oyster peptides group were significantly decreased(p<0.01),while SOD and GSH level were significantly increased compared with control group(p<0.01). These results indicated that the antioxidant peptide fractions of spray-dried oyster product exhibited strong antioxidant activityinvivo.

oyster;peptides;spray drying;antioxidant

2015-08-04

許旻(1987-)，女，碩士，助理研究員，研究方向:海洋生物活性評價，E-mail:xumin1315@foxmail.com。

劉智禹(1971-)，男，博士，教授級高工，研究方向：水產品加工與綜合利用研究，E-mail:13906008638@163.com。

福建省科技重大專項(2014NZ0001-1)；廈門市海洋經濟創新發展區域示范項目(12CZP001SF02)；福建省海洋高新產業發展專項；福建省屬公益類科研院所基本科研專項(2015R1003-10)；福建省水產研究所青年基金項目(2014fjscq01)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)05-0361-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.065