響應面優(yōu)化酶解法制備蒲公英籽蛋白抗氧化肽工藝

張　楊,胡　磊,汪少蕓,洪　晶

(福州大學生物科學與工程學院,福建福州 350116)

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響應面優(yōu)化酶解法制備蒲公英籽蛋白抗氧化肽工藝

張楊,胡磊,汪少蕓,洪晶*

(福州大學生物科學與工程學院,福建福州 350116)

以蒲公英籽蛋白質(zhì)抽提物為原料,采用響應面分析法(RSM)優(yōu)化酶解蒲公英籽蛋白質(zhì)制備抗氧化肽工藝。采用堿性蛋白酶酶解制備蒲公英籽抗氧化肽,以酶解產(chǎn)物對DPPH自由基清除力為評價指標,考察酶解pH、底物濃度、酶底比及酶解溫度對酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響。在單因素實驗的基礎上,采用三因素三水平的響應面分析法確定酶解蒲公英籽蛋白質(zhì)制備抗氧化肽工藝,同時建立酶解工藝的二次項數(shù)學模型并驗證其可靠性。以酶解時間、酶底比和酶解pH為自變量,研究這3個因素的交互作用及最佳酶解工藝條件并進行驗證。研究表明,對酶解蒲公英籽蛋白質(zhì)制備抗氧化肽工藝的影響因素主次順序為:pH>酶底比>酶解時間,最佳酶解工藝條件:酶解時間 4.90 h,pH8.5和酶底比7.80%。在最佳工藝條件下,酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率為79.13%。

響應面法,蒲公英籽,抗氧化肽,酶解工藝

許多人工抗氧化劑如BHT、BHA等都無法避免地帶有潛在的毒副作用。通過食源性的蛋白質(zhì)水解得到的抗氧化肽抗氧化活性高,易吸收,而且無副作用,因此成為研究新型抗氧化劑的熱點。通過酶解法利用植物蛋白制備高活性的抗氧化肽已有廣泛研究,如用螺旋藻蛋白[1]及玉米蛋白[2]等制備抗氧化肽。

蒲公英為菊科多年草本生植物,是我國家喻戶曉的野生蔬菜和中草藥。《千金方》、《本草綱目》等中記載蒲公英具有清熱解毒、消腫散結、利尿通淋之功效[3]。現(xiàn)代研究表明,蒲公英具有抑菌、抗腫瘤、保肝利膽、促進腸胃動力、提高免疫力、清除自由基延緩衰老的作用[4]。除了藥用,蒲公英還可供食用,是一種營養(yǎng)價值極高的野生蔬菜。蒲公英籽作為蒲公英成熟干燥的種子,其營養(yǎng)、活性成分組成與蒲公英全草相似。目前,國內(nèi)外對蒲公英全草的研究較多,而且主要研究蒲公英黃酮、多糖以及萜類化合物,而對蒲公英籽的蛋白及多肽的研究很少。因此,本文以蒲公英籽為原料,采用蛋白酶酶解法制備抗氧化肽,以DPPH自由基清除活力為考察指標,采用Box-Behnken設計實驗,通過響應面法分析各因素對抗氧化肽制備工藝的影響,以優(yōu)化制備工藝獲得最佳工藝條件,為蒲公英籽蛋白的綜合利用提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蒲公英籽福州市種子市場,經(jīng)中藥粉碎機粉碎成粉末后備用;中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶諾特萊斯生物科技有限公司;DPPHSigma公司;其他試劑國產(chǎn)分析純。

XZ-21K型高速冷凍離心機湘智離心機儀器有限公司;EU2600型紫外-可見分光光度計昂拉儀器有限公司;FE20型pH計梅特勒-托利多儀器上海有限公司;KDN-102C定氮儀纖檢儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1蒲公英籽蛋白的酶解工藝堿提酸沉法提取蒲公英籽蛋白,將冷凍干燥后的蒲公英籽粗蛋白粉作為酶解的原料,酶解采用下述工藝進行。

蛋白抽提物→酶解→滅酶→離心→上清液→酶解液

1.2.2水解度的測定甲醛滴定法[5-6]。取水解液5.0 mL于小燒杯中,加入60 mL蒸餾水,磁力攪拌下用0.01 mol/L標準NaOH滴定至酸度計指示pH8.2,加入pH已調(diào)至8.2的甲醛溶液20 mL,記錄將其pH滴至9.2時所消耗的0.01 mol/L標準NaOH溶液的體積。計算公式:

n=(ΔV×C/W)×(V總/V)

htot=(1×Pro%)/110

DH(%)=(n-n0/htot)×100

式(1)

式中,ΔV-滴定樣品與滴定蛋白原液所消耗的標準NaOH溶液體積之差;C-NaOH標準溶液濃度(mol/L);W-原料質(zhì)量(g);V總-酶解液的總體積(mL);V-滴定取用的酶解液體積(mL);n0-水解前每克蛋白游離的氨基毫摩爾數(shù)(mmol/g);n-水解后每克蛋白游離的氨基毫摩爾數(shù)(mmol/g);htot-原料蛋白質(zhì)中所含肽鍵總數(shù)(mmol/g);Pro%-樣品的蛋白質(zhì)含量;110-氨基酸平均分子量。

1.2.3抗氧化活性測定以DPPH自由基清除活力作為指標,考察蒲公英籽酶解物抗氧化能力,參照Chen等人的方法進行測定[7]。

取0.5 mL樣品溶液,加入0.5 mL DPPH溶液(濃度為0.1 mmol/L,溶解于95%的乙醇中進行配制),迅速振蕩、混勻后避光30 min,在517 nm處測定反應液的吸光值,記作Ai。DPPH自由基清除活性通過下式計算:

式(2)

式中,Ai-樣品組(DPPH溶液+樣品);Aj-對照組(95%乙醇溶液+樣品);A0-空白組(DPPH溶液+去離子水)。

1.2.4單因素實驗酶解步驟如1.2.1節(jié),分別對酶的種類(木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶)、底物濃度(0.5%、1%、2%、45、6%、8%)、酶底比(4%、6%、8%、10%、12%、14%)、pH(7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)和酶解溫度(40、45、50、55、60、65 ℃)進行單因素實驗,考察各因素對蛋白質(zhì)酶解工藝的影響。采用甲醛滴定法測定酶解物的水解度,按公式(1)計算。采用DPPH自由基清除活力測定酶解物的抗氧化活性,按公式(2)計算。

1.2.5響應面法優(yōu)化蒲公英籽抗氧化肽酶解工藝實驗在單因素實驗結果的基礎上,根據(jù)Box-Behnken設計原理,采用軟件Design Expert V8.0.6建立三因素三水平實驗,確定蒲公英籽蛋白酶解最佳工藝條件。以酶解物的DPPH自由基清除率(Y,%)為考察指標,酶解時間(A),酶底比(B)及pH(C)為自變量,因素水平編碼見表1。

表1　因素水平編碼表Table 1　Code and level of factors chosen

2　結果與討論

2.1單因素實驗

2.1.1蛋白酶種類對酶解物抗氧化活性的影響選擇木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶對蒲公英籽蛋白進行酶解。4種蛋白酶對蒲公英籽蛋白的水解度與酶解物抗氧化活性隨酶解時間的變化分別如圖1、圖2所示。由圖1、圖2分析可知,堿性蛋白酶的酶解效果最好,胰蛋白酶次之,中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解效果較差,因此選擇堿性蛋白酶為最適作用酶。由堿性蛋白酶的酶解進程曲線分析可知,其水解度在酶解4 h時達到最大后趨于平緩,而其DPPH自由基清除率在酶解4 h以后開始下降,故最適酶解時間選擇4 h。

圖1　不同蛋白酶水解蒲公英籽蛋白的進程曲線Fig.1　Effect of different proteases on dandelion seeds protein hydrolysis

圖2　不同蛋白酶對蒲公英籽酶解物抗氧化活性的影響Fig.2　Effect of different proteases on antioxidant activity of dandelion seeds hydrolysates

2.1.2底物濃度對酶解物抗氧化活性的影響在pH10.0,酶底比8%和酶解溫度為45 ℃的條件下酶解4 h,考察不同底物濃度對蒲公英籽蛋白酶解物抗氧化活性和水解度的影響。由圖3可知,底物濃度小于2%時,酶解物的DPPH自由基清除率和水解度隨底物濃度增加而增大;當?shù)孜餄舛却笥?%時,其清除率和水解度基本不變甚至呈下降趨勢,這是因為在底物濃度較低時,增加底物濃度能增大底物與蛋白酶接觸的機會,使反應向產(chǎn)物方向進行,但當?shù)孜餄舛鹊竭_飽和點時,體系流動性變差,反而不利于底物與酶的接觸[8],因此酶解速率下降,故最適底物濃度為2%。

圖3　底物濃度對蒲公英籽酶解物抗氧化活性的影響Fig.3　Effect of substrate concentration on antioxidant activity of dandelion seeds hydrolysates

2.1.3酶底比對酶解物抗氧化活性的影響在底物濃度為2%(w/v),酶解溫度為45 ℃和pH10.0條件下酶解4 h,考察不同酶底比對蒲公英籽蛋白酶解物抗氧化活性和水解度的影響。如圖4所示,酶解物的DPPH自由基清除率和水解度隨酶量的增加而增大,當酶底比為8%時自由基清除率和水解度都達到最大,隨后增加酶底比自由基清除率和水解度降低。這可能是因為底物濃度一定時,隨著酶量的不斷增加,將已生成的具有抗氧化活性的多肽進一步酶解,生成不具有抗氧化活性或者抗氧化活性更小的肽段或氨基酸[9],因此選擇最適酶底比為8%。

圖4　酶底比對蒲公英籽酶解物抗氧化活性的影響Fig.4　Effect of enzyme/substrate ratio on antioxidant activity of dandelion seeds hydrolysates

2.1.4pH對酶解物抗氧化活性的影響在底物濃度為2%(w/v),酶解溫度為45 ℃,酶底比為8%和酶解時間4 h的條件下,考察不同pH對蒲公英籽酶解物抗氧化活性和水解度的影響。結果如圖5所示,在pH為8.5時,酶解產(chǎn)物的抗氧化活性和水解度都達到最大,當pH高于或低于8.5時,其抗氧化活性和水解度都呈下降趨勢。這是因為酶分子及底物分子的解離狀態(tài)、酶蛋白構象等受pH的影響,進而影響酶與底物的結合、酶穩(wěn)定性及產(chǎn)物轉(zhuǎn)化,最終影響酶促催化效果[10-11]。因此選擇最適酶解pH為8.5。

圖5　pH對蒲公英籽酶解物抗氧化活性的影響Fig.5　Effect of pH on antioxidant activity of dandelionseeds hydrolysates

2.1.5酶解溫度對酶解物抗氧化活性的影響在底物濃度為2%(w/v),酶底比為8%和pH8.5的條件下酶解4 h,考察不同溫度對酶解物抗氧化活性和水解度的影響。由圖6可知,在一定范圍內(nèi),隨著溫度的上升,酶解產(chǎn)物的抗氧化活性和水解度都在增加,當溫度高于45 ℃時,其抗氧化活性和水解度都在顯著下降。這是因為在一定范圍內(nèi),隨溫度升高,反應速率增加、酶解物還原能力增強、水解度升高;但溫度過高會使酶失活、產(chǎn)物形成方向發(fā)生改變,導致水解度的下降[12]。因此最適酶解溫度選擇45 ℃。

圖6　溫度對蒲公英籽酶解物抗氧化活性的影響Fig.6　Effect of temperature on antioxidant activity of dandelion seeds hydrolysates

2.2響應面實驗設計方案和結果分析

溫度、pH和酶底比是影響酶解液活性的主要因素[13],綜合單因素實驗結果,選用堿性蛋白酶水解蒲公英籽蛋白酶,固定底物濃度為2%(w/v),溫度為45 ℃,選酶解時間、酶底比及pH為考察因素,根據(jù)響應面分析法Box-Behnken設計原理進行響應面實驗。從單因素實驗的結果來看,水解度的變化趨勢與DPPH自由基清除率的變化趨勢基本一致,因此選擇DPPH自由基清除率為主要指標。響應面的設計及結果如表2所示。

表3　模型回歸方程方差分析Table 3　ANOVA of regression equation

注:p<0.001代表極顯著“***”;p<0.01代表較顯著“**”;p<0.05代表顯著“*”;p>0.05代表不顯著。

利用Design-Expert V8.0.6軟件進行多元回歸擬合,得到回歸模型方程:

Y=78.08-0.81X1-1.01X2-1.53X3+1.06X1X2-1.13X1X3-0.92X2X3-11.27X12-9.79X22-11.30X32

2.2.1各因素對蒲公英籽酶解液抗氧化活性的影響分析用各因素的F值可評價該因素對實驗指標的影響,F值越大,表明該因素的影響越顯著。由表3可知,F(X1)=11.09,F(X2)=17.19,F(X3)=39.82,即各因素對蒲公英籽蛋白抗氧化活性的影響順序為pH>酶底比>酶解時間。

等高線是響應面中水平方向的投影,等高線的形狀表明變量間的交互作用是否顯著,橢圓等高線表明變量間的交互作用顯著,圓形等高線表明交互作用不顯著[14]。由圖7至圖9可知,酶解時間、pH及酶添加量相互間的等高線都呈明顯的橢圓狀,表明三因素間具有交互作用。

表2　響應面法實驗設計與實驗結果Table 2　Respond surface experimental design and results

如果一個響應曲面坡度相對平緩,表明其可以忍受處理條件的變異,而不影響到響應值大小,相反,如果一個響應曲面坡度非常陡峭,表明響應值對于處理條件的改變非常敏感[15]。由圖7可知,在時間X1與酶底比X2交互作用的響應面中,沿X2軸方向的響應曲面的坡度明顯高于X1,說明酶底比的變化對DPPH自由基清除率的影響相比于時間對其的影響大。從圖8和圖9中可以看出沿X3軸方向的響應曲面比較陡峭,說明pH的變化對DPPH自由基清除率的影響比時間和酶底比的影響大。

圖7　酶底比和酶解時間 對抗氧化肽制備工藝影響的響應面圖(pH=8.5)Fig.7　Responsive surfaces of effect of enzyme/substrate ratio and time on preparation of antioxidant peptides(pH=8.5)

圖8　酶解時間和pH對抗氧化肽 制備工藝影響的響應面圖(酶底比=8.0%)Fig.8　Responsive surfaces of effect of time and pH on preparation of antioxidant peptides(amount of enzyme=8.0%)

圖9　酶底比和pH對抗氧化肽 制備工藝影響的響應面圖(時間=5.0 h)Fig.9　Responsive surfaces of effect of enzyme/substrate ratio and pH on preparation of antioxidant peptides(time=5.0 h)

綜上分析,各變量對酶解蒲公英籽蛋白質(zhì)制備抗氧化肽工藝的影響主次順序為:pH>酶底比>酶解時間。

2.2.2最佳提取條件的確定及驗證由Design-Expert V8.0.6軟件分析得最佳實驗條件為:酶解時間4.86 h,pH8.45和酶底比7.76%。鑒于實驗的可操作性,將最佳酶解條件調(diào)整為:酶解時間4.90 h,pH8.5和酶底比7.80%,其理論DPPH自由基清除率為79.96%。通過多次(n>3)實驗后測得最佳條件下蒲公英籽酶解液的DPPH自由基清除率為79.13%,與理論自由基清除率無顯著性差異,其相對誤差為0.59%,說明通過響應面法優(yōu)化得到的模型回歸方程及最佳條件可靠。

3　結論

利用響應面法建立酶解蒲公英籽蛋白質(zhì)制備抗氧化肽工藝的二次項數(shù)學模型。通過方差分析,該模型顯著,所得回歸方程擬合度好。影響酶解蒲公英籽蛋白質(zhì)制備抗氧化肽工藝的各因素主次順序為pH>酶底比>酶解時間。最佳提取工藝條件是:pH8.5,酶解時間4.90 h和酶底比7.80%。在此條件下,測得蒲公英籽蛋白質(zhì)酶解物對DPPH自由基的清除率為79.13%,與理論自由基清除率(79.96%)無顯著性差異,說明通過響應分析法得到的回歸方程能夠較好預測實驗結果。

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Optimization of enzymolysis technology for preparation of antioxidant peptides from dandelion seeds-derived proteins by response surface methodology

ZHANG Yang,HU Lei,WANG Shao-yun,HONG Jing*

(College of Biological Science and Engineering,Fuzhou University,Fuzhou 350116,China)

The aim of this study was to optimize the hydrolysis technology of preparation of antioxidant peptides from dandelion seeds protein using response surface methodology(RSM). The protein extracted from dandelion seeds was hydrolyzed by alcalase and antioxidant activity of the hydrolysates was evaluated by DPPH radical scavenging activity. Effects of pH,substrate concentration,enzyme/substrate ratio and temperature on DPPH scavenging activity of hydrolysates were evaluated. Based on the results of the single factor experiments,a procedure optimized using the response surface analysis with three factors(pH,enzyme/substrate ratio and hydrolysis time)was conducted in order to obtain the optimal enzymolysis condition. The quadratic term model of the enzymatic preparation technology was established and the reliability was verified. The interaction effects of pH,enzyme/substrate ratio and time were investigated,and the optimal hydrolysis condition was obtained and checked out experimentally. The results indicated that the effect order of the three factors on antioxidant activity of protein hydrolysates was pH>enzyme/substrate ratio>hydrolysis time,and the optimal enzymolysis conditions were time of 4.90 h,pH8.5 and enzyme/substrate ratio of 7.80%. Under the optimal enzymolysis conditions,DPPH radical scavenging rate of the hydrolysates was 79.13%,which indicated that the protein hydrolysates possessed strong antioxidant activity.

response surface methodology;dandelion seed;enzymolysis technology;antioxidant peptides

2015-06-05

張楊(1991-),女,碩士研究生,研究方向:食品生物技術,E-mail:xiah520@163.com。

洪晶(1981-),女,博士，副教授，研究方向:生物化學與分子生物學,E-mail:jhong@fzu.edu.cn。

福建省科技廳資助項目(2013J05050)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)05-0258-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.042