辣木葉水溶性蛋白的超聲微波萃取及其性質研究

呂曉亞,白新鵬,*,伍曾利,楊慧強,熊桂林

(1.海南大學食品學院,海南?？?570228;2.海南思坦德生物科技股份有限公司,海南海口 570000)

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呂曉亞1,白新鵬1,*,伍曾利2,楊慧強1,熊桂林2

(1.海南大學食品學院,海南?？?570228;2.海南思坦德生物科技股份有限公司,海南?？?570000)

研究辣木葉中可溶性蛋白的提取工藝及其性質。采用超聲-微波協同萃取方法提取辣木葉中可溶性蛋白,在單因素實驗的基礎上,通過Box-Behnken 中心組合實驗確定最佳工藝參數,并對蛋白質氨基酸組成進行分析。實驗結果表明:當料液比1∶160(g/mL),微波功率40 W,提取時間127 s,pH11,在此工藝條件下,辣木葉蛋白得率為40.11 mg/g。氨基酸分析表明,辣木葉可溶性蛋白中必需氨基酸含量為280.7 mg/g,含硫氨基酸含量較高,蘇氨酸為第一限制性氨基酸。差示掃描量熱儀(DSC)分析表明辣木葉可溶性蛋白的變性溫度為113.7 ℃。

辣木葉,超聲微波,蛋白質

辣木(Moringaoleifera),又名鼓槌樹,為辣木科(Moringaceae)、辣木屬(MoringaAdans)多年生木本植物,原產于熱帶、南亞熱帶的干旱或半干旱地區,在我國主要種植于臺灣、廣東、海南、云南等南方地區。辣木中含有十分豐富而全面的營養成分,具有降血糖、降血壓、保護肝臟、保護心臟、抗菌消炎等作用[1],廣泛應用于食品、藥品和工業生產中。其中,辣木葉中含有豐富的纖維素、蛋白質、維生素以及微量元素[2]。研究表明[3],辣木葉蛋白質中含有19種氨基酸,其中含有8種人體生命活動所需的必需氨基酸,與花生、大豆、棉籽等其他植物性蛋白相比,辣木葉蛋白的生物效價和營養價值均較高,是一種極具開發潛力的優質植物性蛋白,2012年我國國家衛生和計劃生育委員會將辣木葉批準為新資源食品。

近些年超聲-微波協同萃取技術廣泛應用于提取植物中的生物活性物質,利用超聲振動的空化作用以及微波的高能作用[4]能有效縮短提取時間,加速植物中有效成分溶出,降低高溫對熱敏物質的影響,提高其提取效率與提取質量。辣木葉作為一種新資源食品,國內外研究較少,且主要集中于其抗菌和抗氧化以及動物飼養等方面,關于其蛋白質方面的研究較少。本實驗以辣木葉為原料,采取超聲-微波輔助堿法提取辣木葉水溶性蛋白,并采用響應面法對pH、微波功率、提取時間以及料液比四個因素,與其交互作用進行優化,研究超聲-微波協同提取辣木葉可溶性蛋白的最佳工藝,并對提取出的蛋白質進行理化性質分析,為辣木葉蛋白的深入研究和工業化生產提供有效的參考依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

辣木葉采自海南大學種植園(粗蛋白含量為18.46%);牛血清白蛋白生化純,國藥集團化學試劑有限公司;其他試劑均為分析純。

FW177型中草藥粉碎機天津市泰斯特儀器有限公司;SH220型石墨消解儀濟南海能儀器有限公司;CW-2000型超聲-微波協同萃取儀新拓微波溶樣測試技術有限公司;101-1-BS型電熱恒溫鼓風干燥箱上海躍進醫療儀器廠;GL-20G-II型低溫冷凍離心機上海安亭科學儀器廠;PHS-3D型pH計上海精科？;EL204型電子天平梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;923型可見光分光光度計上海奧普勒儀器有限公司;FDU-2100冷凍干燥機上海愛朗儀器有限公司;Q100差示掃描量熱儀(DSC)美國TA儀器公司;2695型高效液相色譜waters公司(美國)。

1.2工藝流程

辣木葉→蒸餾水洗凈→50 ℃干燥→粉碎→加浸提溶劑→超聲微波協同萃取→離心5000 r/min,15 min→上清液→蛋白質含量測定→酸沉→離心8000 r/min,10 min→沉淀→冷凍干燥

1.3單因素實驗

1.3.1溶劑pH對辣木葉可溶性蛋白得率的影響準確稱取一定質量的辣木葉粉在料液比1∶80(g/mL),微波功率50 W,超聲微波處理時間120 s的前提下,改變溶劑pH(8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5),對辣木葉可溶性蛋白進行提取,計算蛋白得率。

1.3.2料液比對辣木葉可溶性蛋白得率的影響準確稱取一定質量的辣木葉粉在pH10.5,微波功率50 W,超聲微波處理時間120 s的前提下,改變料液比(1∶60、1∶80、1∶100、1∶120、1∶140、1∶160、1∶180),對辣木葉可溶性蛋白進行提取,計算蛋白質得率。

1.3.3微波功率對辣木葉可溶性蛋白得率的影響準確稱取一定質量的辣木葉粉在pH10.5,料液比1∶140 g/mL,超聲微波處理時間120 s的前提下,改變微波功率(40、50、60、70、80 W),對辣木葉可溶性蛋白進行提取,計算蛋白質得率。

1.3.4超聲微波處理時間對辣木葉可溶性蛋白得率的影響準確稱取一定質量的辣木葉粉在pH10.5,料液比1∶140 g/mL,微波功率50 W的前提下,改變超聲微波處理時間(60、120、180、240、300 s),對辣木葉可溶性蛋白進行提取,計算蛋白質提取率。

1.3.5不同pH對辣木葉可溶性蛋白酸沉的影響取蛋白質上清液30 mL,調節不同的pH(2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6),8000 r/min 10 min,測上清液中可溶性蛋白質的含量。

1.4Box-Behnken中心設計

在單因素提取實驗基礎上,采用Box-Behnken中心設計原理,對影響辣木葉蛋白得率的料液比、微波功率、超聲微波處理時間、溶劑pH采用Design-Expert.8.05b分析軟件設計了4因素3水平中心組合設計,實驗因素水平設計見表1、實驗方案與結果見表2。

表1　實驗因素水平及編碼表Table 1　Levels and factors of orthogonal design

1.5測定方法

1.5.1蛋白質測定方法考馬斯亮藍G-250法[5]

Y:蛋白質得率(mg/g)；m1:提取液中蛋白質量(mg)；m2:辣木葉樣品質量(g)。

1.5.2氨基酸分析準確稱取100mg的辣木蛋白冷凍干燥后樣品,加6mol/LHCl,110 ℃水解22h,取1mL氨基酸水解液真空干燥,加入1mLpH2.2的鹽酸溶解,過0.45μm濾膜,溶液轉移到樣品瓶中備用。采用AccQ·Tag氨基酸分析方法進行分析(參考Waters公司AccQ·Tag化學試劑包使用手冊)。

1.5.3氨基酸評價采用WHO人體必需氨基酸模式,將辣木葉蛋白中必需氨基酸含量除以參考的蛋白質中必需氨基酸含量,比值最低者,為限制性氨基酸。由于限制性氨基酸的存在,使得食物中蛋白質的利用率降低,因而降低辣木葉蛋白的生物利用率。

蛋白質的氨基酸評分=每g待評蛋白質中某種必需氨基酸含量(mg)/每g標準蛋白中某必需氨基酸含量(mg)×100

1.5.4辣木葉可溶性蛋白熱變性溫度的測定參照文獻[6-7]的方法,將上清液裝入已處理好的透析袋中(截留分子量在14ku),4 ℃透析脫鹽24h,真空干燥濃縮,取一定質量的濃縮液,放入特定的鋁盒,以空白為對照,氮氣為載氣,掃描溫度范圍20～200 ℃,升溫速率為10 ℃/min條件下進行DSC分析。

1.6數據處理方法

所有實驗進行三次平行實驗,數據采用Design-Expert8.0.5b軟件統計學方法進行處理。

2　結果與分析

2.1辣木葉可溶性蛋白提取的單因素實驗

2.1.1溶劑pH對辣木葉可溶性蛋白得率的影響由圖1可知,在使用超聲微波法提取蛋白中,蛋白質得率隨著溶劑pH的升高呈先升高后降低的趨勢,在8.5～10.5范圍內,得率逐漸升高,在pH10.5時達到最高,為33.88mg/g,隨后蛋白質得率開始緩慢下降。這是由于蛋白質在強堿環境中會發生極端變性,從提取液中沉淀出來,從而降低了提取液中可溶性蛋白的含量。此外,加入過多量的堿會引起蛋白質的脫氨、脫羧反應,對辣木葉蛋白的理化性質和營養價值造成不利影響,故pH選擇10.5。

圖1　pH對蛋白得率的影響Fig.1　Effect of pH on the yield of protein

2.1.2料液比對辣木葉可溶性蛋白得率的影響由圖2可知,隨著溶劑體積的不斷增加,蛋白質得率呈逐漸增加的趨勢,當料液比為1∶140 g/mL時,辣木葉蛋白質得率達到最高值40.00 mg/g。這是因為增加溶劑量,使得辣木葉粉與溶劑接觸面的濃度差增加,提高了傳質速率。液料比繼續增加時,溶液的黏度增大,蛋白質溶出的阻力增大,導致蛋白質得率下降,因此確定料液比為1∶140 g/mL。

圖2　料液比對蛋白得率的影響Fig.2　Effect of ratio of meal to solvent on the yield of protein

2.1.3微波功率對辣木葉可溶性蛋白得率的影響由圖3可知,隨著微波功率的增大,蛋白質得率出現先增大后減小的趨勢,在微波功率為50 W時,蛋白質得率達到最大值40.02 mg/g。繼續增加微波功率,蛋白質得率開始下降,這可能是由于微波功率過大易造成溫度過高使蛋白質分解,導致蛋白質的得率降低。因此微波功率選用50 W。

圖3　微波功率對蛋白得率的影響Fig.3　Effect of microwave power on the yield of protein

2.1.4超聲微波處理時間對辣木葉可溶性蛋白得率的影響由圖4可知,在處理時間為120 s時,上清液中蛋白質的含量最高為39.96 mg/g,隨著時間的延長,蛋白質含量開始下降。這可能是由于超聲微波輻射在較短時間內對辣木葉細胞膜的破碎作用明顯,蛋白質溶出多,所以得率上升較快。但當蛋白質的溶解度接近飽和時,水溶性物質不再溶解,且隨著時間的延長,超聲微波過程中不斷產熱,使蛋白質發生變性,從而影響蛋白質的品質。

圖4　處理時間對蛋白得率的影響Fig.4　Effect of extract time on the yield of protein

2.1.5不同pH對辣木葉可溶性蛋白酸沉的影響由圖5可知,在酸沉pH為3.2時,上清液中殘留的蛋白質含量最少,體系pH為蛋白質的等電點,此時,蛋白質正、負電荷數相同,蛋白質與蛋白質之間由于靜電排斥作用降低而發生聚合沉淀。因此在pH為3.2的條件下,酸沉所得到的蛋白質最多,由此可知辣木葉蛋白的等電點在3.2附近。

圖5　pH對蛋白質酸沉的影響Fig.5　Effect of pH on protein acid precipitation

2.2Box-Behnken 中心設計及其響應面法優化辣木葉可溶性蛋白的提取工藝

4因素3 水平中心組合設計實驗因素水平及結果見表2。

由表2可知,辣木葉可溶性蛋白得率與料液比、微波功率、處理時間、溶液pH四因素的數學回歸模型為:

Y=38.64+0.54A-0.49B+1.45C+2.61D+0.17AB+1.77AC-0.54AD+1.91BC-3.19BD-0.84CD-1.52A2-1.35B2-1.87C2-1.76D2

表2　實驗設計及結果Table 2　Results of the orthogonal experiment

回歸分析結果見表3。根據方差分析顯著性檢驗結果可知:該模型回歸顯著,且方程決定系數(R2)為0.8690,該模型與實驗擬合度較好,自變量與響應值影響顯著,說明該回歸方程適用于辣木葉可溶性蛋白提取的理論預測。其中C、D、BD、C2對辣木葉可溶性蛋白質得率的影響高度顯著,AC、BC、A2、B2、D2對辣木葉可溶性蛋白提取的影響顯著,A、B、AB、AD、CD對辣木葉可溶性蛋白提取的影響不顯著。影響辣木葉可溶性蛋白提取的主次因素依次為D>C>A>B,即pH>提取時間>液料比>微波功率。在σ=0.05顯著水平剔除不顯著項,得出優化后的方程:

Y=38.64+1.45C+2.61D+1.77AC+1.91BC-3.19BD-1.52A2-1.35B2-1.87C2-1.76D2。

為進一步確定最佳點,利用Design-Expert.8.0.5.0軟件對工藝條件進行優化,可得辣木葉蛋白提取的最佳條件為:料液比1∶160,微波功率40 W,提取時間127 s,pH11,在此工藝條件下,辣木葉蛋白得率的預測值為40.16 mg/g。為驗證響應面分析方法的可靠性,采用上述最優條件進行蛋白的提取,并與表2中實驗結果較好的1號及15號在相同的實驗條件下作對比實驗,并進行三次重復驗證實驗。在最優條件下測得辣木葉蛋白的得率為40.11 mg/g,1號工藝條件下平均得率為39.42 mg/g,15號工藝條件下的平均得率為39.86 mg/g。結果證明,在最佳工藝條件下,辣木葉蛋白的浸出量均超過前面任一條件下的,同時也證明了響應面分析方法的可靠性。因此采用響應面分析方法優化得到的辣木葉可溶性蛋白提取條件參數準確,具有一定實用價值。

表3　回歸分析結果Table 3　Regression analysis of Box-Behnken design

注:*為0.05水平上顯著,**為0.01水平上顯著。

2.3辣木葉可溶性蛋白的氨基酸分析

對辣木葉可溶性蛋白氨基酸組成與含量進行了分析,并對幾種必需氨基酸進行化學評分。辣木葉可溶性蛋白氨基酸組成與含量見表4。由于酸水解使色氨酸完全破壞,谷氨酰胺、天冬酰胺轉變為谷氨酸和天冬氨酸,因此酸水解測定氨基酸中沒有色氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的值。另外,絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸在酸水解處理過程中受到某種程度的破壞,所以他們的測定值比實際值要低。甘氨酸可能由于其含量較低而未能檢出。

由表4可見,辣木葉可溶性蛋白中氨基酸組成比較豐富,含有16種氨基酸,總量為861.8 mg/g,其中包括7種必需氨基酸,總量為280.7 mg/g,非極性氨基酸占總氨基酸含量的30.28%,中性極性氨基酸占總量的27.22%,帶正電荷氨基酸占總量的22.64%,帶負電荷氨基酸含量占總量的19.86%,16種氨基酸中半胱氨酸和谷氨酸含量較高,分別占氨基酸總量的17.07%,12.79%。

表5　辣木葉可溶性蛋白的氨基酸評分Table 5　Amino acid score of Moringa leaf soluble protein

表4　辣木葉可溶性蛋白氨基酸組成與含量(mg/g)Table 4　The composition and content of amino acid in Moringa leaf soluble protein(mg/g)

注:“-”表示未檢出。

由表5可知,在辣木葉可溶性蛋白氨基酸組成中,必需氨基酸含量豐富,與人體需求較為接近,其中含硫氨基酸含量較高,蘇氨酸為第一限制性氨基酸,其氨基酸評分為83。與其他植物蛋白相比,辣木葉可溶性蛋白是一種優質的蛋白質資源。

2.4辣木葉可溶性蛋白的熱變性溫度

熱變性溫度是蛋白質加工的一個重要影響因素,溫度升高使得蛋白質變性,蛋白質三、四級結構展開,導致產品的功能性質明顯降低或喪失[9]。蛋白質的變性溫度受水分含量影響變化很大,由于含水量低會使得蛋白質的聚集效應增加,峰形變寬,峰值溫度升高,變性焓增加。蛋白質的變性溫度體現在蛋白質稀溶液的變性溫度,蛋白質只有溶解于水中,才能呈現出特定的三維立體結構來支撐蛋白質的各種功能性質[10],因此本實驗對辣木葉可溶性蛋白稀溶液進行DSC掃描確定其變性溫度。由圖6可知,在100～120 ℃溫度范圍內出現一個吸熱峰,峰值變性溫度為113.7 ℃,高于麥胚球蛋白和大豆分離蛋白[11]。由于二硫鍵是蛋白質中唯一的共價交聯鍵,二硫鍵含量越高,二硫鍵斷開所需的能量就越大,蛋白質的變性溫度就越高,由氨基酸分析結果可知,辣木葉可溶性蛋白中半胱氨酸含量較高,占氨基酸總量的17.07%,因此辣木葉可溶性蛋白具有較高的熱變性溫度。

圖6　辣木葉可溶性蛋白稀溶液的DSC 掃描圖Fig.6　DSC scan of Moringa leaf soluble protein in dilute solution

3　結論

以辣木葉干粉為原料,采用超聲-微波協同萃取辣木葉可溶性蛋白,在單因素實驗的基礎上,通過Box-Behnken 中心組合實驗確定最佳工藝參數:料液比1∶160(g/mL),微波功率40 W,提取時間127 s,pH11,在此工藝條件下,提取的辣木葉蛋白含量為40.11 mg/g,為辣木葉可溶性蛋白的大規模提取提供了一個有效的工藝參數。但超聲-微波輔助提取的辣木葉可溶性蛋白與傳統方法提取的辣木葉蛋白在結構和功能性質上的區別有待進一步的研究和探討。

通過氨基酸分析可知,辣木葉可溶性蛋白氨基酸種類比較齊全,必需氨基酸含量為280.7 mg/g,各氨基酸含量與推薦標準接近,含硫氨基酸含量較高,蘇氨酸為第一限制性氨基酸,與其他植物蛋白相比,辣木葉可溶性蛋白是一種優質的蛋白質資源。

由于辣木葉可溶性蛋白中半胱氨酸含量較高,二硫鍵含量高,使得其稀溶液的變性溫度較高,為113.7 ℃,略高于其他植物蛋白。但稀溶液中水分含量對辣木葉可溶性蛋白質熱穩定性的影響有待進一步深入研究。

[1]賀艷培,王倩,孔令鈺.辣木的研究進展[J].天津科技,2013,2:87-90.

[2]Nouman Wasif，Siddiqui Muhammad，Basra Shahzad，et al. Biomass production and nutritional quality of Moringa oleifera as a field crop[J].Turkish Journal of Agriculture and Forestry,2013,37:410-419.

[3]Moyo Busani，Masika Patrick，Hugo Arnold，et al. Nutritional characterization of Moringa(Moringa oleifera Lam.)leaves[J]. African Journal of Biotechnology,2011,10(60):12925-12933.

[4]Kapper，Alexander. Microwaves in organic and medicinal chemistry[M]. Weinheim：Wiley-VCH,2005.

[5]王永華.食品分析(第二版)[M].北京:中國輕工業出版社,2011:128.

[6]黃友如,華欲飛,王曉虹.DSC在大豆蛋白功能性質研究中應用[J].糧食與油脂,2003,08:15-17.

[7]盧雁,李向榮.蛋白質變性機理與變性時的熱力學參數研究進展[J].化學進展,2005,17(5):905-910.

[8]FAO/WHO. Energy and Protein requirement[R].RePort of joint FAO/WHO,Geneva:WHO,1973.63.

[9]Noisuwan Angkana，Bronlund John，Wilkinson Brian，et al. Effect of milk protein products on the rheological and thermal(DSC)properties of normal rice starch and waxy rice starch[J]. Food Hydrocolloids，2008,22(01):174-183.

[10]朱科學,周惠明.麥胚球蛋白的分離制備及理化性質研究[J].中國糧油學報,2005,20(6):15-18.

[11]于源,張敏,邵弘.差示掃描量熱法在大豆蛋白產品品質檢測中的應用[J].大豆通報,2008,1:26-28,36.

Extraction and physicochemical properties of soluble protein from Moringa leaves by ultrasonic and microwave

LV Xiao-ya1,BAI Xin-peng1*,WU Zeng-li2,YANG Hui-qiang1,XIONG Gui-lin2

(1.Food college,Hainan University,Haikou 570228,China;2.Hainan Standard Bio-Technique Corp.,Ltd,Haikou 570000,China)

To study the extraction and physicochemical properties of soluble protein from Moringa leaves. Application of ultrasonic and microwave assisted extraction of protein was studied using dry Moringa leaves as a raw material by single factor experiment. The best extraction conditions were determined by Box-Behnken center united experimental design as follows:the ratio for material and liquid was 1∶160(g/mL),microwave power of 40 W,extracting time of 127 seconds,pH value of 11,under which the yield of protein in the extracts reached 40.11 mg/g. Amino acid analysis showed that content of essential amino acids of Moringa leaf protein was 280.7 mg/g. The content of sulfur amino acid was high. The first limiting amino acid(LAA)was threonine. Differential scanning calorimetry(DSC)analysis showed that the soluble protein thermal denaturation temperature of Moringa leaf was 113.7 ℃.

Moringa leaves;ultrasonic and microwave;protein

2015-06-29

呂曉亞(1990-)，女，碩士研究生(在讀)，研究方向：農產品貯藏及加工，E-mail:lxy5409@sina.com。

白新鵬(1963-)，男，博士，教授，研究方向：糧食、油脂和植物蛋白質工程，E-mail:xinpeng2001@126.com。

國家高技術研究發展計劃(863計劃)：蛋白質微生物發酵技術研究(2013AA10 2203-08)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)05-0212-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.033