胭脂蘿卜廢渣中提取蘿卜硫素的酶解工藝優(yōu)化

陽　暉,趙學勤,李昌滿,孫鐘雷,李　宇,李　敏,鄧　鑫,胡　葦

(長江師范學院生命科學與技術學院,重慶涪陵 408100)

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胭脂蘿卜廢渣中提取蘿卜硫素的酶解工藝優(yōu)化

陽暉,趙學勤,李昌滿,孫鐘雷,李宇,李敏,鄧鑫,胡葦

(長江師范學院生命科學與技術學院,重慶涪陵 408100)

以胭脂蘿卜廢渣為原料,提取蘿卜硫素。為提高蘿卜硫素的得率,優(yōu)化了胭脂蘿卜廢渣中蘿卜硫苷的酶解條件。在單因素實驗的基礎上,以響應面分析法分別探討了四個主要影響因素(酶解溫度、酶解時間、pH、抗壞血酸(VC)添加量)對胭脂蘿卜廢渣中蘿卜硫素得率的影響,并進一步優(yōu)化了硫代葡萄糖苷酶解條件。結果表明:在酶解溫度為31 ℃,酶解時間為7.7 h,pH5.6,VC添加量為0.24 mg/kg條件下,蘿卜硫素的得率最高為0.05613%,其結果與模型預測值相符。這說明采用響應面法優(yōu)化獲得的提取條件較可靠。

蘿卜硫素,酶解,胭脂蘿卜廢渣,響應面

蘿卜硫素(又名萊菔子素),屬于異硫代氰酸鹽衍生物,其分子式C6H11S2NO,分子質(zhì)量的大小為177.29[1]。它是蘿卜硫苷經(jīng)過內(nèi)源性或外源性的黑芥子硫苷酶(葡萄糖硫苷酶)或者酸水解后產(chǎn)生的一類異硫代氰酸鹽衍生物[2]。

圖1　蘿卜硫苷酶解生成異硫氰酸鹽[2]Fig.1　Glucosinolates produced isothiocyanates by enzymatic hydrolysis[2]

蘿卜硫素具有抗菌、抗癌、抗氧化和提高機體免疫力等藥理作用,從而受到國內(nèi)外學者的廣泛關注[3-4]。大規(guī)模生產(chǎn)蘿卜硫素產(chǎn)品不論是作為藥品或是食品方面,都具有廣闊的市場應用前景。目前,主要采用兩種方式生產(chǎn)蘿卜硫素,一種是酶法,另一種是化學合成法。化學反應條件很難控制,并且生產(chǎn)成本非常高,故很少采用化學法生產(chǎn)蘿卜硫素[2,5-6]。現(xiàn)有的大多數(shù)研究都是從十字花科蔬菜或其種子中直接提取蘿卜硫素前體,然后經(jīng)水解獲得蘿卜硫素[2]。但由于蘿卜硫素的本身含量較低,因此生產(chǎn)蘿卜硫素需要消耗大量的原料,導致生產(chǎn)成本較高。

胭脂蘿卜,十字花科蘿卜屬的草本植物,是重慶涪陵地區(qū)的三大特產(chǎn)之一。它皮心全紅、富含蘿卜紅色素,是提取食用天然色素蘿卜紅素的理想原料之一[7]。然而,在紅色素生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生的大量蘿卜廢渣,這些廢渣幾乎全部被廢棄,這不僅造成資源的浪費,還容易污染環(huán)境。如何將這些廢渣變廢為寶,是胭脂蘿卜色素生產(chǎn)企業(yè)迫切需要解決的問題。

課題組研究發(fā)現(xiàn)這些蘿卜廢渣中不僅含有大量生成蘿卜硫素前體物質(zhì)-蘿卜硫苷,而且還含有可以降解蘿卜硫苷生成蘿卜硫素的葡萄糖硫苷酶,因此,可以利用胭脂蘿卜廢渣來制備蘿卜硫素。這不僅降低生產(chǎn)蘿卜硫素的成本,而且還有利于胭脂蘿卜廢渣的循環(huán)利用,變廢為寶,同時,為大規(guī)模開發(fā)蘿卜硫素系列產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

胭脂蘿卜廢渣重慶丹青生物技術有限公司,廢渣回收后,在-18 ℃冷凍保存。

二氯甲烷、抗壞血酸、溴甲酚綠、甲基紅、六氫吡啶、鹽酸、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉天津市化學試劑一廠,以上試劑均為分析純。

ZSD-1090電熱鼓風干燥箱上海智城分析儀器制造有限公司;303-3植物組織攪碎機江蘇省車臺縣電器廠;RE-500旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海一凱儀器設備有限公司;SG2pH計梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司;HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1工藝流程蘿卜廢渣→勻漿→調(diào)pH、添加催化劑→酶解→干燥→提取→抽濾→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→粗提物→得率測定

1.2.2操作要點勻漿:按料液比為5∶2將水加入到蘿卜廢渣中,然后進行打漿。

pH調(diào)節(jié)、酶解:添加適量的VC作為催化劑,用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)蘿卜廢渣的pH，在35 ℃水浴中酶解8 h。

干燥:酶解后的蘿卜廢渣,在40～50 ℃干燥。干燥的時間控制18～19 h,以基本無水分,呈粉末狀為準。

提取、抽濾:按固液比為1∶30,在干燥后的蘿卜廢渣中加入萃取劑(二氯甲烷),超聲波萃取30 min,在25 ℃,放置3 h。將萃取后的混合液抽濾2次,回收濾液,備用,提取3次。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā):將上述濾液在40 ℃旋轉(zhuǎn)濃縮至無萃取劑為止,再用少量二氯甲烷將產(chǎn)物洗滌出來,最后用分液漏斗進行分離,獲得蘿卜硫素粗提物。

1.2.3測定方法采用滴定法對蘿卜硫素粗提物進行測定[9]。

1.2.4單因素實驗設計

1.2.4.1不同pH對胭脂蘿卜廢渣中蘿卜硫素得率的影響添加0.2 mg/kg的VC,調(diào)節(jié)pH分別為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5,在35 ℃酶解8 h,測定蘿卜硫素的得率。

1.2.4.2不同酶解時間對胭脂蘿卜廢渣中蘿卜硫素得率的影響添加0.2 mg/kg的VC,然后調(diào)節(jié)pH為5.5,在35 ℃酶解0、4、8、12、16 h,測定蘿卜硫素的得率。

1.2.4.3不同酶解溫度對胭脂蘿卜廢渣中蘿卜硫素得率的影響添加0.2 mg/kg的VC,然后調(diào)節(jié)pH為5.5,分別在15、25、35、45、55 ℃的水浴中酶解8 h,測定蘿卜硫素的得率。

1.2.4.4不同VC添加量對胭脂蘿卜廢渣中蘿卜硫素得率的影響分別添加0、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/kg的VC,調(diào)節(jié)pH至5.5,在35 ℃酶解8 h,測定蘿卜硫素的得率。

1.2.5響應面實驗設計為了進一步探討pH、酶解時間、酶解溫度以及VC添加量對蘿卜硫素得率的影響,以蘿卜硫素得率為檢測指標,在單因素實驗的基礎上,采用響應面實驗,對主要影響因素進行進一步優(yōu)化。響應面實驗的水平、因素見表1。

表1　實驗設計的水平及因素Table 1　Factors and levels of experiments design

1.2.6蘿卜硫素得率的計算

1.3數(shù)據(jù)分析

用Excel和Design Expert 8.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2　結果與分析

2.1單因素實驗結果與分析

2.1.1不同pH對胭脂蘿卜廢渣中蘿卜硫素得率的影響不同來源的葡糖硫苷酶最適pH范圍不同,在pH4～9之間均能找到活性最高的葡糖硫苷酶同工酶。不同pH對胭脂蘿卜廢渣中蘿卜硫素得率的影響,結果見圖2。

圖2　pH對蘿卜硫素得率的影響Fig.2　Effect of pH on yield of sulforaphane

由圖2可知,pH對胭脂蘿卜中葡萄糖硫苷酶活性影響很大。過低或過高的pH都會降低硫苷酶的活性,甚至使得酶失去活性,無催化活性。從圖中可以看出,當pH在5.5時,蘿卜硫素的得率達到最大,酶解效果較佳。這與修麗麗在其研究中發(fā)現(xiàn)的甘藍中葡萄糖硫苷酶的最適pH在5.5～6.5之間,是一致的[10]。當pH遠離5.5,隨著pH的增大或減小,蘿卜硫素的得率逐漸減少。

2.1.2不同酶解時間對胭脂蘿卜廢渣中蘿卜硫素得率的影響由圖3可知,當酶解時間小于8 h,蘿卜硫素的得率隨著時間的增加快速上升;在8 h蘿卜硫素的得率達到最大值,這主要由于8 h之前酶解時間不夠,酶解效果隨時間的增加變化較大。酶解時間超過8 h,蘿卜硫素的得率有所降低,這主要受兩方面的影響:一方面,少數(shù)蘿卜硫素長時間接觸空氣所發(fā)生的自身降解或氧化而損失,另一方面,過度酶解造成其他的異硫氰酸酯類物質(zhì)的產(chǎn)生,從而降低了蘿卜硫素的得率[11]。因此,提取蘿卜硫素的較佳酶解時間為8 h。

圖3　酶解時間對蘿卜硫素得率的影響Fig.3　Effect of hydrolysis time on yield of sulforaphane

2.1.3不同酶解溫度對胭脂蘿卜廢渣中蘿卜硫素得率的影響由圖4可知,當酶解溫度在15～35 ℃時,隨著溫度的升高,蘿卜硫素的得率顯著提高(p<0.05);在35 ℃時,蘿卜硫素得率最高,說明蘿卜硫苷的酶解效果最好;當酶解溫度超過35 ℃時,隨著溫度的升高,其蘿卜硫素的得率急速下降,獲得蘿卜硫素的含量明顯減少。這說明胭脂蘿卜中的酶活性與溫度密切相關。不同種類的硫苷酶最適溫度不同,Bo Pontoppidan等人研究發(fā)現(xiàn)在藍蚜蟲中分離純化得到葡糖硫苷酶,最適溫度為40 ℃[12]。這可能是由于兩方面的因素所致:一方面偏離最適溫度會使得酶的活性會降低,甚至沒有酶解能力;另一方面,由于蘿卜硫素在較高的溫度下不穩(wěn)定,容易分解也會造成蘿卜硫素得率的降低。因此,較佳酶解溫度為35 ℃。

根據(jù)采樣定理,當采樣率大于信號中最高頻率的2倍時,采樣之后的數(shù)字信號完整地保留了原始信號中的數(shù)據(jù)。本系統(tǒng)采樣率為25 ksample/s,當電機轉(zhuǎn)速為10 r/s時,頻率為2 000 Hz,完全滿足采樣定理,所以該系統(tǒng)適用于該轉(zhuǎn)速系統(tǒng)的數(shù)據(jù)采集。數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)連接包絡檢波器采集讀取天線端電壓幅值,之后將獲得的數(shù)據(jù)采用MATLAB仿真得到天線端電壓幅值隨時間變化曲線。

圖4　酶解溫度對蘿卜硫素得率的影響Fig.4　Effect of hydrolysis temperature on yield of sulforaphane

2.1.4不同VC添加量對胭脂蘿卜廢渣中蘿卜硫素得率的影響胭脂蘿卜中的內(nèi)源性硫苷酶的活性受到很多因素的影響,比如:VC和Fe2+等金屬離子可作為葡糖硫苷酶的激活劑[9]。不同VC添加量對胭脂蘿卜廢渣中蘿卜硫素得率的影響,結果如圖5。

由圖5可知,當添加VC的含量小于0.2 mg/kg時,隨著催化劑的添加,蘿卜硫素的得率明顯增加。主要是由于VC使得硫苷酶的酶活顯著提高,在此過程中,硫苷酶的構象也發(fā)生了輕微的變化所致。當添加VC的添加量在大于0.2 mg/kg時,蘿卜硫素的得率逐漸下降,這可能由于硫苷酶活性增強后,反應加快,可能催化生成了其他的異硫氰酸酯類物質(zhì),而降低蘿卜硫素的含量。綜上所述,較佳的VC添加量為0.2 mg/kg。

圖5　VC添加量對蘿卜硫素得率的影響Fig.5　Effect of VC content on yield of sulforaphane

2.2響應面優(yōu)化結果與分析

2.2.1響應面實驗結果與分析上述單因素實驗已經(jīng)確定pH、VC的添加量、酶解時間、酶解溫度的取值范圍,采用響應面實驗的方法,以提取的蘿卜硫素得率為參考指標,篩選出最佳的優(yōu)化組合,結果見表2，方差分析結果見表3。

表2　響應面分析方案及實驗結果Table 2　Program and test results of response surface analysis

表3　得率回歸模型的方差分析Table 3　Variance analysis of regression equation on yield

注:**表示極顯著,p<0.01;*表示顯著,0.01

通過響應面曲面圖的分析可知,最終求得二次多元方程為:Y=0.056+0.0002288A+0.00104B+0.00007634C-0.001377D+0.0008822AB+0.000389AC-0.0004103AD-0.0003223BC-0.001675BD+0.00112CD-0.002389A2-0.002506B2-0.002951C2-0.00269D2。

由表3方差分析結果可知,該回歸方程(模型)的回歸效果極顯著(p<0.01),失擬項不顯著,說明模型擬合程度好,有實際應用意義。各因素對得率影響的大小順序分別為:D(酶解溫度)>B(VC添加量)>A(pH)>C(酶解時間)。對響應值得率作用極顯著的是D、A2、B2、C2和D2,顯著的是B、BD、CD。由此可見,實驗各因素對蘿卜硫素得率的影響并非簡單的線性關系。在p=0.05水平下剔除不顯著項,對原模型進行優(yōu)化可得,Y=0.056+0.00104B-0.001377D-0.001675BD+0.00112CD-0.002389A2-0.002506B2-0.002951C2-0.00269D2。

2.2.2交互作用對胭脂蘿卜硫素得率的影響根據(jù)回歸方程做出響應面分析圖(結果見圖6和圖7),考察pH、VC添加量、酶解時間和酶解溫度對蘿卜硫素得率的影響。

圖6　VC添加量與酶解溫度對得率的影響Fig.6　Effect of VC content and hydrolysis temperature on yield

圖7　酶解時間與酶解溫度對得率的影響Fig.7　Effect of hydrolysis time and hydrolysis temperature on yield

兩個因素的等高線越密集,形狀越趨向橢圓,表明兩個因素的交互作用越明顯。由圖6可知,酶解溫度的變化坡度較VC添加量的坡度變化大,且酶解溫度的等高線變化數(shù)量多于VC添加量,說明酶解溫度對蘿卜硫素得率的影響大于VC添加量的影響,且VC添加量和酶解溫度有較強的交互作用;同理可知,在圖7中酶解溫度對得率的影響大于酶解時間的影響,且酶解時間和酶解溫度有較強的交互作用。

2.2.3提取條件優(yōu)化及驗證經(jīng)優(yōu)化,提取蘿卜硫素的最佳工藝參數(shù)為:pH5.64,VC添加量為0.24 mg/kg,酶解時間:7.71 h,酶解溫度:31.02 ℃。為驗證響應曲面法所得結果的可靠性,考慮到實際操作的便利,將工藝參數(shù)修正為:pH5.6,VC添加量為:0.24 mg/kg,酶解時間:7.7 h,酶解溫度:31 ℃。在此條件下進行3次驗證實驗,測得的蘿卜硫素的得率為0.05613%,與預測值0.0564823%接近,說明采用響應面法優(yōu)化獲得的提取條件可靠。

3　結論

采用Box-Behnken實驗設計,以得率為響應值,優(yōu)化pH、VC添加量和酶解溫度、酶解時間四個因素,方差分析顯示所建模型回歸效果極顯著,擬合度好。最佳的酶解條件為:酶解溫度31 ℃,酶解時間7.7 h,pH為5.6,VC的添加量為0.24 mg/kg。在此條件下,蘿卜硫素的得率為0.05613%。

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Optimization of enzymatic hydrolysis conditions for extracting sulforaphane from waste of carmine radish

YANG Hui,ZHAO Xue-qin,LI Chang-man,SUN Zhong-lei,LI Yu,LI Min,DENG Xin,HU Wei

(Department of Life Science & Tech,Yangtze Normal University,Chongqing 408100,China)

In this study,sulforaphane was extracted from the waste of carmine radish. In order to enhance the yield of sulforaphane,enzymatic hydrolysis conditions of glucosinolates in waste of carmine radish were optimized. Based on single-factor experiments,the effects of four factors(the hydrolysis temperature,hydrolysis time,amount of VC,pH value)on the yield of sulforaphane were investigated by response surface methodology. Experimental results showed that,when the hydrolysis temperature was 31 ℃,hydrolysis time was 7.7 h,amount of VCwas 0.24 mg/kg,pH was 5.6,the yield of sulforaphane was the highest with the value of 0.05613%,which were according with the predicted value of model. This indicated that extraction conditions which analyzed by response surface method were more reliable.

sulforaphane;enzymatic hydrolysis;waste of carmine radish;response surface methodology

2015-07-15

陽暉(1981-)，女，碩士研究生，講師，研究方向：食品加工與分析檢測，E-mail:yanghui-ren@sohu.com。

重慶市教委科學技術研究項目(KJ1401214)。

TS255.3

B

1002-0306(2016)05-0207-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.032