高血壓大鼠心肌肥厚瞬時外向鉀電流的變化比較

張良勝，翟超楠，劉星.河南省永城市人民醫院東城區心內科，河南永城　476600；.瀘州醫學院附屬醫院心內科，四川瀘州　646000

高血壓大鼠心肌肥厚瞬時外向鉀電流的變化比較

張良勝1，翟超楠1，劉星2
1.河南省永城市人民醫院東城區心內科，河南永城476600；2.瀘州醫學院附屬醫院心內科，四川瀘州646000

目的比較腹主動脈縮窄模型組（Coarctation of abdominal aorta，CAA）與假手術組（Sham operation，SH）的心肌細胞瞬時外向鉀電流的變化。方法2012年1—6月于瀘州醫學院20只成年大鼠，被隨機分成兩組：假手術組（Sham operation，SH）（n=10）與腹主動脈縮窄模型組（n=10）（Coarctation of abdominal aorta，CAA）。運用膜片鉗技術分別記錄兩組大鼠心室肌單細胞的Ito，運用OriginPro 8.0，Clampfit 10軟件數據分析作圖。結果假手術組左心室心肌細胞的Ito電流密度+70 mv時（37.05±5.02）pA/pF比腹主動脈縮窄模型組大鼠+70mv時（16.09±8.91）pA/pF高差異有統計學意義（P＜0.05），與假手術組相比，腹主動脈縮窄模型組的Ito的I-V曲線下移明顯。結論Ito在高血壓心肌肥厚角色，可能是臨床嚴重心律失常的發生原因之一。

高血壓大鼠心肌肥厚，膜片鉗，瞬時外向鉀電流

［Abstract］Objective To investigate the variations of the transient outward potassium current（Ito）on ventricular myocardium between coarctation of abdominal aorta and sham operation.Methods 20 healthy adult rats were divided into sham operation group（SH）（n=10）and coarctation of abdominal aorta group（CAA）（n=10）from January to June in 2012 in Luzhou Medical College.Whole-cell path clamp technique was used to record the unicellular changes of Ito in left ventricular myocytes for SH group and CAA group.Both Clampfit 10 and OriginPro 8.0 software was used for data analysis.Results The Ito current density of left ventricular myocytes was significantly higher in sham operation group （37.05±5.02）pA/pF at+70 mv than in coarctation of abdominal aorta group（16.09±8.91）pA/pF at+70 mv（P＜0.05），Compared with sham operation group，the I-V curve of Ito in coarctation of abdominal aorta group was more depressed than in the sham operation group markedly.Conclusion Ito plays an important role in hypertrophic myocardium of hypertensive rats.It may be one of the important reasons of arrhythmia.

［Key words］Hypertrophic myocardium of hypertensive rats，Pacth clamp，Transient outward potassium current

高血壓心肌肥厚是機體對血流動力學負荷增加的一種反應，表現為心室壁增厚，心肌重量增加，心肌重構。左心室肥厚常伴有心律失常，心力衰竭等一系列心血管事件，是心血管事件的獨立危險因素［1-2］。2012年1—6月該研究建立10例高血壓心肌肥厚模型，利用膜片鉗技術檢測心室肌細胞瞬時外向鉀電流（Ito）的變化，以明確Ito電流在高血壓心肌肥厚中的變化情況。

1　材料與方法

1.1實驗動物與分組

2012年1—6月，將20只清潔Sprague Dawley大鼠隨機分為 SH組（10例）與CAA組（10例），Sprague Dawley大鼠購于第三軍醫大學醫學實驗動物中心。

1.2試劑與主要儀器

羥乙基哌嗪乙磺酸，乙二醇雙四乙酸，氯化鈷，天冬氨酸鉀，牛磺酸，血清白蛋白，膠原酶II，谷氨酸均為Sigma公司產品，其余為國產分析純試劑。

膜片鉗放大器 （CEZ-2300，Nihon konden，Japan）；A/D轉換器（Digidata 1322A，Axon Instruments，USA）；倒置相差顯微鏡（WN 203，Narishige，Japan）；電極經橫式拉制機（P-97 sutter，USA）；超聲震蕩器（JG-4301，China）；體視顯微鏡（S8APO，LEICA，Germany）；Millipore超純水儀 （Elix3/Mini-QBicel，Millipore，USA）；Langendorff灌流裝置（ML176，Austrilia）；LETICA加熱裝置（LE13206，USA）；PH測定儀（EUTECH，USA）。

1.3實驗方法

1.3.1高血壓心肌肥厚模型制備 按照Roussel E等［3］報道的方法建模。20只SD大鼠隨機分成假手術組（n=10），腹主動脈縮窄模型組（n=10），術前用套尾法用大鼠無創血壓計測量儀測量大鼠血壓，每只測3次，取平均值。同時用3%戊巴比妥鈉0.2 mL/100 g腹腔麻醉，沿中線切開腹腔后，推開腸管，暴露后腹膜，于右腎上方分離長約3 mm腹主動脈，穿線結扎，拔出針管，制備腹主動脈縮窄模型，假手術組除了結扎外，其余與腹主動脈縮窄模型組。術后一周套尾法測量大鼠血壓≥150 mmHg為造模成功。造模結束，喂養4周。

1.3.2分離心肌細胞按照張良勝［4］等報道的方法分離心肌細胞：①首先用95%O2將酶液、KB液和無鈣臺氏液飽和30 min，打開恒溫浴槽。②沖洗Langendorff系統，時間約10 min。③3%戊巴比妥鈉0.2 mL/ 100 g腹腔麻醉成功后，打開大鼠胸腔，取出心臟，心臟固定在Langendorff系統上。④無鈣臺氏液沖洗，再換成消化酶液，沖洗速度8 mL/min，沖洗時間7～8 min，每分鐘取一次心臟組織，取出后裝在有KB液的10個小瓶中。⑤剪碎心肌組織塊，吸管輕輕吹打，細胞混懸液過濾后4℃冰箱中備用。

1.3.3全細胞膜片鉗記錄瞬時外向鉀電流 按照張良勝等報道的方法記錄瞬時外向鉀電流。采樣方式為Clampex下的Episodic stimulation，采樣頻率為10 KHz［5-6］。

1.8統計方法

數據用Originpro 8.0進行統計分析實驗結果以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較用t檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2　結果

2.1病理切片結果觀察

大鼠病理結果如下：SH組心肌細胞纖維排列整齊，橫紋清楚，細胞間隙正常，間質豐富（圖1）。CAA組，心肌細胞排列紊亂，心肌細胞增粗肥大，間質水腫（圖2）。

圖1　SH組心肌細胞染色（HE，200倍）

圖2　CAA組心肌細胞染色（HE，200倍）

2.2各組大鼠血壓變化情況

兩組達鼠在術前1周和術后4周血壓變化值比較，見表1。

表1　各組大鼠血壓變化值（±s）

表1　各組大鼠血壓變化值（±s）

組別　術前一周（mmHg）　術后4周（mmHg）SH組（n=10）CAA組（n=10）t P 105±4.64 104±6.25 -1.020 0.335 106±6.34 158±6.58 -26.346 0.000

2.3心室肌細胞Ito電流變化

鉗制電壓在-80 mv，以10 mv為階躍，-50 mv開始去極化，去極化至+70 mv，鉗制時間300 ms引出Ito電流（圖3）。分析記錄Ito的電流強度，電流密度。

2.3.1電流密度從-40～-20 mv電位下，CAA組Ito電流密度略高于SH組，在鉗制電位-10～+70mv，CAA 組Ito密度低于SH組（P＜0.05），指令電壓+70 mv時SH組（37.05±5.02）pA/pF，CAA組為（16.09±8.91）pA/ pF，差異有統計學意義（P＜0.001）（表2）。

表2　各組Ito的電流密度（±s）

表2　各組Ito的電流密度（±s）

注：+70 mv電壓下，CAA組與SH組相比差異有統計學意義，t= 16.052，P＜0.000。

V（mv）CAA組（n=10）I/C （pA/pF）SH組（n=10）I/C （pA/pF）-50 -40 -30 -20 -10 0 +10 +20 +30 +40 +50 +60 +70 0.14±0.11 0.20±0.30 1.13±1.1 2.15±2.34 3.40±3.35 4.52±4.25 5.60±5.3 7.1±6.22 8.10±7.01 9.30±7.35 10.74±7.91 14.5±9.2 16.09±8.91 0.04±0.01 0.061±0.04 0.47±0.43 1.90±0.80 4.32±2.02 6.72±2.80 8.80±3.10 12.30±4.0 15.07±4.32 21.05±4.6 25.90±5.02 30.11±4.52 （37.05±5.02）*

2.3.2I-V曲線 兩組的I-V曲線呈線性依賴性，呈內向整流特性，從指令電壓-50～-20 mv，曲線走向相對平緩。從指令電壓-20～+70 mv，SH組增幅較大，CAA電流增幅較小，在指令電壓+10 mv以后更明顯（圖3、4）。

圖3　CAA組與SH組心室肌細胞Ito的I-V曲線

圖4　各組電流圖及Ito刺激方案：A.SH組 B.CAA組 C.Ito刺激方案

3　討論

原發性高血壓是以動脈壓升高為重要特征，長期的血壓增高嚴重損傷心腦腎等重要器官，甚至出現生命意外。高血壓心肌肥厚是機體對血流動力學負荷增加的一種反應，表現為心室壁增厚，心肌重量增加，心肌重構，心力衰竭等一系列心血管事件，是心血管事件的獨立危險因素，病情進展者易導致心律失常和心力衰竭，心律失常的發生可加重心肌損害，惡化心功能，甚至引起患者猝死。

心肌肥厚的造模方法主要有［7］：①物理法：主要通過外界機械力、溫度等條件改變，誘發動物形成疾病模型的過程。主要包括：運動導致心肌肥厚、容量負荷法、壓力超負荷法和心肌梗死致心肌肥厚。容量負荷法、壓力超負荷法和心肌梗死致心肌肥厚均采用手術的方法造模，這些方法造模時間短，價格低廉，重復性好，但創傷大，易造成腹腔感染［8-9］。②化學法：利用各種藥物或者化學試劑對機體產生作用，形成心肌肥厚模型。最常用的為藥物誘導，操作簡單，心肌改變明顯，耗時短，心肌改變明顯等優點。③生物法：主要通過轉基因技術或動物自身遺傳因素獲得某種疾病模型的方法，主要有轉基因心肌肥厚動物模型和自發性高血壓大鼠模型。

心肌細胞存在鈉鉀鈣等多種離子通道，這些離子的正常分布和離子流規律活動是維持心肌細胞正常電活動的基礎。K+是重要的離子流之一，對動作電位時程的長短具有決定性作用。其中Ito在心肌動作電位（active potential，AP）0相時被激活并參與了AP 1相復極過程。Ito分為Ito1和Ito2，Ito1研究較多，大多時候Ito是指Ito1，Ito1對2相動作電位的起始水平有重要的作用，不但參與Na+-Ca2+交換，也參與了LCa2+通道的活性調節，對動作電位時程有影響［10］。有報道認為Ito的減弱，心室復極時間延長，引發各種心律失常。研究Ito在高血壓心肌肥厚中的變化有重要的臨床意義。

該研究顯示：在鉗制電壓為+70 mv時，CAA組的電流密度較SH組降低明顯，差異有統計學意義（P＜0.05），CAA組I-V曲線較SH組I-V曲線下移明顯。該研究與劉星［11-12］等報道的瞬時外向鉀電流在糖尿病心肌病中的變化結論一致，通過本研究說明當高血壓心肌肥厚時，Ito的變化顯著，這可能是高血壓心肌肥厚易發生心律失常的原因之一。

總之，高血壓心肌肥厚除了心肌結構改變外，也存在電活動的改變，其中Ito在高血壓心肌肥厚電活動改變扮演著重要角色，研究該離子通道的相關影響因素及改變，利于闡明高血壓心肌肥厚電活動的發生發展機制。

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Comparison of Transient Outward Potassium Current in Hypertrophic Myocardium of Hypertensive Rats

ZHANG Liang-sheng1，ZHAI Chao-nan1，LIU Xing2
1.Department of Cardiology，Yongcheng People’s Hospital of Henan Province，Yongcheng，Henan Province，476600 China；2.Department of Cardiology，Affiliated Hospital of Luzhou Medical College，Luzhou，Sichuan Province，646000 China

R54

A

2096-1782（2016）07-0004-03

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.07.004

張良勝（1980-），男，河南永城人，碩士，主治醫師，主要從事心血管內科。

2016-04-05）