氫醌對骨髓間充質干細胞PARP-1表達的影響

高羽亭1.廣東醫科大學公共衛生學院勞動衛生與環境衛生教研室，廣東東莞　523808；2.東莞市環境醫學重點實驗室，廣東東莞 523808

氫醌對骨髓間充質干細胞PARP-1表達的影響

高羽亭1，2
1.廣東醫科大學公共衛生學院勞動衛生與環境衛生教研室，廣東東莞523808；2.東莞市環境醫學重點實驗室，廣東東莞 523808

目的探討氫醌（HQ）對骨髓間充質干細胞（BMSCs）PARP-1基因表達的影響。方法2015年1月—2015年3月在東莞市環境醫學重點實驗室以BMSCs為對照組，以PARP-1沉默BMSCs為處理組，磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解HQ，分別以0、2.5、5.0、10.0、20.0和40.0 μmol/L HQ染毒兩組細胞，應用實時熒光定量-聚合酶鏈反應檢測兩組細胞PARP-1基因表達的改變。結果與PBS組對比，2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L HQ染毒24 h后，BMSCs細胞PARP-1表達量分別為1.39倍、1.65倍（P＜0.05）、1.69倍（P＜0.05）、1.76倍（P＜0.05）和1.5倍（P＜0.05）；沉默細胞PARP-1表達量分別為1.37倍（P＜0.05）、1.58倍（P＜0.05）、1.84倍（P＜0.05）、2.15倍（P＜0.05）和1.93倍（P＜0.05）；與BMSCs細胞相比，沉默細胞中PARP-1表達水平下降了78%（P＜0.05）差異均無統計學意義。結論 兩組細胞PARP-1表達水平隨HQ劑量增加先升后降，PARP-1沉默能增加BMSCs對HQ的敏感性。

氫醌；骨髓間充質干細胞；聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1

［Abstract］Objective To explore the influences of hydroquinone（HQ）in the expression of poly（ADP-ribose）polymerase-1（PARP-1）gene in bone mesenchymal stem cells（BMSCs）.Methods We did experiment in Dongguan Key Laboratory of Environmental Medicine from January 2015 to March 2015 BMSCs with PARP-1 silencing were sorted as the treated group，while BMSCs were considered as the control group.HQ dissolved in PBS buffer at the concentrations of 0，2.5，5.0，10.0，20.0and 40.0 μmol/L were respectively given to both cells.The PARP-1 gene expression was determined by reverse transcription real-time RT-PCR assay All the differences is statistically significant.Results Compared with PBS control group，in 2.5，5.0，10.0，20，40 μmol/L HQ groups 24 h after exposure，the expressions of PARP-1 of normal cells were1.39，1.65（P＜0.05），1.69（P＜0.05），1.76（P＜0.05）and 1.5 fold（P＜0.05）and those of defective cells were1.37（P＜0.05），1.58（P＜0.05），1.84（P＜0.05），2.15（P＜0.05）and1.93 fold（P＜0.05）.Compared with the control group，the expression of PARP-1 was reduced by 78%（P＜0.05）.Conclusion The express level of PARP-1 of both cells treated with different doses of HQ increased at first and then decreased.

［Key words］Hydroquinone；Bone mesenchymal stem cells；Poly（ADP-ribose）polymerase-1

氫醌（Hydroquinone，HQ）在工農業生產中應用廣泛，人類可通過多種途徑接觸如環境、職業接觸、吸煙、食物等［1］。HQ也是苯的重要代謝物之一，在人體中主要作用于骨髓［2］。骨髓造血微環境的重要成分之一就是骨髓間充質干細胞 （bone mesenchymal stem cells，BMSCs），它能夠維持造血干細胞的特性及歸巢［3］。作為一種廣泛存在于真核細胞中的核酶，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1［Poly（ADP-ribose）polymerase-1，PARP-1］參與了DNA損傷的修復和細胞凋亡等過程，在應對遺傳毒性反應過程中發揮著重要作用［4］。以往對HQ毒效應的研究多選用淋巴細胞或造血細胞，關于HQ對骨髓間充質干細胞的研究很少。我們于2015年1月—2015年3月在東莞市環境醫學重點實驗室以體外培養的大鼠BMSCs細胞和PARP-1沉默細胞為研究對象，以HQ為受試物，對PARP-1基因表達進行檢測，探討PARP-1基因在氫醌導致的骨髓間充質干細胞DNA損傷修復中的作用。

1　材料與方法

1.1試劑

逆轉錄試劑盒（立陶宛Fementas）；TRIzol Reagent（美國Invitrogene）；熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒（德國Roche）；氫醌、DMSO和MTT（美國Sigma）；胎牛血清（杭州四季青）；低糖DMEM培養基（美國Gibco）。

1.2BMSCs細胞培養

大鼠BMSCs細胞株由該實驗室保存，以1×105/mL接種于培養瓶中，以含10%胎牛血清的DMEM培養液在37℃5%CO2100%濕度條件下培養。

1.3PARP-1基因的RNAi表達質粒轉染BMSCs

以LipofectamineTM 2000介導，按照說明書將由本實驗室前期研究建立的PARP-1基因RNAi表達質粒PARP-1-shRNA轉染至大鼠BMSCs。以BMSCs細胞為對照組，以PARP-1沉默BMSCs細胞為處理組。

1.4PARP-1基因mRNA表達水平檢測

1.4.1細胞總RNA提取按4×105細胞/孔密度將正常細胞和轉染細胞接種于6孔板，貼壁后分別給予2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L HQ染毒，設置PBS對照。24 h后提取細胞總RNA。紫外分光光度計測定總RNA含量和純度，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1.4.2PARP-1實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測以上述RNA樣品為模板，逆轉錄反應制備cDNA，qRT-PCR檢測PARP-1表達量，引物見表1。用2-△△CT法定量分析，采用比較Ct值法，以ACTB為內參基因校正上樣量，計算公式為：倍數改變=2-△△CT，其中△△CT=△CT實驗-△CT對照，△CT=CTPARP-1-CTACTB，試驗重復3次。

表1　PCR引物序列

1.5統計方法

2　結果

染毒24 h后，qRT-PCR法檢測兩種細胞PARP-1基因表達。與BMSCs細胞相比，PARP-1-shRNA細胞中PARP-1表達水平下降了78%，說明沉默效果良好。與PBS組（1.03±0.14）相比，2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/LHQ處理的BMSCs細胞PARP-1表達量分別為（1.39±0.08）倍、（1.65±0.12）倍（P＜0.05）、（1.69± 0.19）倍（P＜0.05）、（1.76±0.19）倍（P＜0.05）和（1.5±0.03）倍（P＜0.05）；與PBS組（1.00±0.03）相比，沉默細胞PARP-1表達量分別為（1.37±0.03）倍（P＜0.05）、（1.58±0.06）倍（P＜0.05）、（1.84±0.08）倍（P＜0.05）、（2.15±0.12）倍（P＜0.05）和（1.93±0.09）倍（P＜0.05）差異均無統計學意義。與PBS組相比，兩組細胞PARP-1表達均隨HQ劑量增加呈先增后降趨勢。HQ濃度為20 μmol/L時，2種細胞PARP-1基因表達最高。HQ濃度增加到40.0 μmol/L時，兩種細胞PARP-1表達水平明顯降低，且正常細胞降低的幅度更大，見圖1。

圖1　BMSCs及其PAPR-1沉默細胞HQ染毒24h后PARP-1基因mRNA表達水平

3　討論

作為造血微環境主要成分的骨髓間充質干細胞的功能和結構的完整性對于保持機體造血的穩定性非常重要［5］。職業人群接觸某些毒物后，可抑制骨髓的造血功能，造成血液系統病變。

苯暴露可導致人類白血病，HQ是苯毒性離體實驗研究常用的替代物質，具有強氧化性，能引起DNA損傷斷裂［6］。PARP-1是DNA損傷所致的細胞早期應激反應的重要分子，可結合到DNA的損傷位點并被激活，參與DNA損傷的修復［7］。DNA損傷后的修復狀況對于細胞轉歸非常重要。如果不能迅速修復，則會導致細胞死亡；如果不能正確修復，則會導致基因變異，誘發癌癥。然而PARP-1表達水平的高低將影響DNA損傷修復的結局。實驗結果顯示，染毒24 h后，與PBS組相比，PARP-1-shRNA細胞中PARP-1表達水平比正常BMSCs下降了78%，2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L HQ處理細胞PARP-1的mRNA表達量分別為（1.37±0.03）倍、（1.58±0.06）倍、（1.84±0.08）倍、（2.15±0.12）倍，顯而易見，沉默細胞中PARP-1本底值雖然不高，但低劑量的HQ對其仍然具有一定的誘導作用。大量研究證明，PARP-1能夠參與DNA修復、細胞分化和死亡等，PARP-1表達增高有利于修復DNA的損傷［8］。當HQ增加到40 μmol·L后，PARP-1表達開始下降。陶恭華［9］等人研究發現，對于16HBE細胞及其PARP-1缺陷細胞株，當BaP染毒劑量小于10 μmol/L時，PARP-1表達隨著染毒劑量增加而增加，當超過染毒劑量10 μmol/L時，PARP-1表達開始下降，PARP-1表達的變化趨勢與本研究結果一致，原因可能是PARP-1自身可作為多聚腺苷二磷酸（ADP）核糖基化作用的底物，發生自身修飾，可導致PARP-1的降解，進而表達量下降［10］。雖然沉默細胞PARP-1表達水平下降的幅度比正常細胞小，但是因為其本底值不高，最終其表達水平仍比正常細胞低。有研究表明，由于PAPR-1沉默細胞喪失了部分修復能力，將導致其喪失誘導細胞死亡的能力，因此在環境不良因素作用下，帶有堿基損傷的細胞可能向惡性轉化，最終導致腫瘤的發生［11］。

綜上所述，低劑量HQ可誘導兩種細胞PARP-1表達水平的升高，當HQ到達一定劑量后PARP-1表達反而會減低，且PARP-1沉默細胞對HQ的損傷敏感性更高。以上結果提示，PARP-1基因參與了HQ所引起的DNA損傷的修復過程，PARP-1的升高有利于DNA損傷的修復，過度升高或水平過低都將影響DNA損傷的修復。但是進一步的證據以及PARP-1表達改變的機制尚待進一步研究。

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Influences of Hydroquinone in Expression of Poly（ADP-ribose）Polymerase-1 Gene in Bone Mesenchymal Stem Cells

GAO Yu-ting1，2
1.Department of Labor Hygiene and Environmental Hygiene，School of Public Health，Guangdong Medical University，Dongguan，Guangdong Province，523808 China；2.Dongguan Key Laboratory of Environmental Medicine，Dongguan，Guangdong Province，523808 China

R329

A

2096-1782（2016）07-0001-04

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.07.001

廣東省自然科學基金資助課題（2015A030310532）；廣東省湛江市非資助科技攻關計劃課題（2013B01084）。

高羽亭（1982.10-），女，安徽安慶人，博士，講師，主要從事毒理學方面的研究。