葛根與地龍聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的預(yù)防作用及其機(jī)制探討

徐文強(qiáng)，楊瑩，彭井華，陳貞月，王占坤，馬雙雙，宋小莉

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355)

?

葛根與地龍聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的預(yù)防作用及其機(jī)制探討

徐文強(qiáng)，楊瑩，彭井華，陳貞月，王占坤，馬雙雙，宋小莉

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355)

目的觀察葛根與地龍聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的預(yù)防作用，并探討其可能機(jī)制。方法106只Wistar大鼠隨機(jī)分為7組，A組以0.787 5 g/kg葛根+0.525 g/kg地龍灌胃，B組予1.575 g/kg葛根+1.05 g/kg地龍，C組予1.575 g/kg葛根，D組予1.05 g/kg地龍，E組予6.3 mg/kg尼莫地平片，F(xiàn)、G組均予0.9%生理鹽水10 mL/kg。連續(xù)給藥14 d后，A、B、C、D、E、F組均制備局灶性腦缺血再灌注損傷模型，G組除不插栓線外，全過程同其他組。計(jì)算各組腦組織腦梗死體積，采用水溶性四氮唑法檢測(cè)血清超氧化物歧化酶(SOD)，硫代巴比妥酸法檢測(cè)血清丙二醛(MDA)，比色法檢測(cè)血清乳酸脫氫酶(LDH)。結(jié)果與G組比較，F(xiàn)組腦梗死體積增加，血清SOD活性降低，LDH、MDA含量升高；與F組比較，A、B、C、D、E組腦梗死體積減少，B組血清SOD活性升高及LDH、MDA含量降低；與C組比較，B組腦梗死體積減少，血清SOD活性升高，LDH、MDA含量降低；與D組比較，A、B組腦梗死體積減少，血清SOD活性升高，MDA含量降低。結(jié)論葛根與地龍聯(lián)合應(yīng)用可有效預(yù)防大鼠腦缺血再灌注損傷，尤以高劑量葛根、地龍聯(lián)合應(yīng)用效果更佳，其機(jī)制可能與增加血清SOD活性及降低LDH、MDA含量有關(guān)。

葛根；地龍；腦缺血再灌注損傷；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

缺血性腦血管疾病是人類致殘和致死的主要病因之一，其發(fā)病率逐年升高，患病人群也有年輕化趨勢(shì)。積極尋找新的抗腦缺血藥物、提高現(xiàn)有藥物的臨床療效是目前亟待解決的難題。在中藥歸經(jīng)理論中，引經(jīng)藥可以引導(dǎo)與之配伍的其他藥物達(dá)于病所，從而提高療效[1]。葛根為陽(yáng)明經(jīng)的引經(jīng)藥，能升陽(yáng)明清氣、引藥上行。文獻(xiàn)[2～4]報(bào)道，針刺陽(yáng)明經(jīng)腧穴可改善腦卒中患者運(yùn)動(dòng)功能，明顯改善患者血液流變學(xué)指標(biāo)，療效顯著。因此，通過配伍引藥葛根，借助其引經(jīng)報(bào)使作用，對(duì)于提高抗腦缺血藥物的療效具有重要的意義。本研究觀察了葛根與地龍聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的預(yù)防作用，并探討其可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品與試劑SPF級(jí)Wistar大鼠106只，雌雄各半，體質(zhì)量280～300 g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供。地龍、葛根(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)，尼莫地平(山東新華制藥股份有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，TTC染色試劑、PBS緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及葛根、地龍用法健康Wistar大鼠106只，實(shí)驗(yàn)條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為7組，A、B、C、D、E、F組各16只，G組10只。A組大鼠以0.787 5 g/kg葛根+0.525 g/kg地龍灌胃，B組予1.575 g/kg葛根+1.05 g/kg地龍，C組予1.575 g/kg葛根，D組予1.05 g/kg地龍，E組予6.3 mg/kg尼莫地平片，F(xiàn)、G組均予0.9%生理鹽水10 mL/kg。

1.3腦缺血再灌注損傷模型制備連續(xù)給藥14 d后，各組大鼠均經(jīng)1%戊巴比妥(30 mg/kg)腹腔麻醉后，分離頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈。G組不進(jìn)行任何操作，縫合傷口；其余各組均采用大腦中動(dòng)脈線栓法[5]建立局灶性腦缺血再灌注損傷模型，即結(jié)扎頸總動(dòng)脈以及頸外動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈下穿線備用，在頸總動(dòng)脈作一切口，將栓線從切口插入到頸內(nèi)動(dòng)脈，松開動(dòng)脈夾，插入18～20 mm遇到阻力即可用備用穿線固定，縫合傷口后，將大鼠放入籠中，并采取保溫措施。缺血2 h將栓線拔離動(dòng)脈分叉口。再灌注24 h后參照文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行五分制標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，無神經(jīng)功能缺損癥狀計(jì)0分，不能完全伸展右側(cè)前肢計(jì)1分，向右側(cè)旋轉(zhuǎn)計(jì)2分，向右側(cè)傾倒計(jì)3分，不能自發(fā)行走、意識(shí)障礙計(jì)4分，去除評(píng)分為0分和4分的大鼠。

1.4大鼠腦組織腦梗死體積測(cè)算腦缺血2 h再灌注24 h后，各組大鼠麻醉后斷頭取腦，于-20 ℃冰箱中速凍20 min，將鼠腦切成5片，隔2 mm切一片。將切片置于2%TTC中，用錫箔紙蓋住后，放入37 ℃溫箱15～30 min，不時(shí)翻動(dòng)腦片，使均勻接觸到染色液。用Image pro plus6.0測(cè)得梗死面積，各腦片梗死面積之和乘以厚度(2 mm)為總的梗死體積，結(jié)果以梗死灶體積占全腦體積的百分率表示。

1.5大鼠血清SOD活性及MDA、LDH含量檢測(cè)缺血再灌注24 h后，大鼠腹主動(dòng)脈取血5 mL。3 500 r/min離心10 min，取上清液，采用水溶性四氮唑法檢測(cè)血清SOD活性，硫代巴比妥酸法測(cè)定血清MDA，比色法測(cè)定血清LDH，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠腦梗死體積比較去除神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分為0分和4分的大鼠以及在飼養(yǎng)過程中死亡的大鼠，每組樣本數(shù)為8只。A、B、C、D、E、F、G組大鼠鬧梗死體積分別為15.660 0%±5.901 6%、13.160 0%±7.581 9%、24.760 0%±7.669 4%、20.760 0%±7.969 9%、27.760 0%±6.193 0%、35.570 0%±3.959 1%，F(xiàn)組與G組比較，A、B、C、D、E組與F組比較，A、B組與C組比較，B組與D組比較，P均<0.05。

2.2各組大鼠血清SOD活性及LDH、MDA含量比較大鼠血清SOD活性及LDH、MDA含量比較見表1。

表1　　　　各組大鼠血清SOD活性及LDH、MDA含量

注：與G組比較，*P<0.01；與F組比較，ΔP<0.05；與C組比較，★P<0.05；與D組比較，#P<0.05。

3　討論

腦血管病是目前公認(rèn)的三大死亡原因之一，在我國(guó)腦血管病的病死率僅次于惡性腫瘤[7]。腦缺血占腦血管病的80%～85%，臨床上一般用溶栓治療來解除梗塞,建立缺血區(qū)域血流再灌注，讓缺血組織和器官重新獲得氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并清除有害的代謝產(chǎn)物。然而，近年研究發(fā)現(xiàn)[8]，及時(shí)恢復(fù)血液再灌注雖有利于減輕缺血損傷，使某些可逆性損傷在功能上獲得恢復(fù)，但缺血后恢復(fù)血流也有其不利的一面，如某些情況下出現(xiàn)能導(dǎo)致組織損傷和功能障礙進(jìn)一步加重的再灌注損傷。因此，尋找有效的預(yù)防腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)藥物、提高藥物療效、減少不良反應(yīng)是目前抗腦缺血藥物研究的熱點(diǎn)。

引經(jīng)是在中醫(yī)藥學(xué)歸經(jīng)與配伍理論基礎(chǔ)上，經(jīng)過長(zhǎng)期臨床實(shí)踐總結(jié)出的用藥經(jīng)驗(yàn)。引經(jīng)藥指藥物對(duì)某些臟腑經(jīng)絡(luò)有特殊的親和作用，因而對(duì)這些部位的病變具有主要或者特殊的治療作用。古人云：“引經(jīng)之藥，劑中用為向?qū)В瑒t能接引眾藥，直入本經(jīng)，用力寡而獲效捷也。”利用引經(jīng)藥可引導(dǎo)相應(yīng)中藥以及靶向藥物進(jìn)入病所病灶來扶正祛邪。臨床上常用的引經(jīng)藥有葛根、柴胡、桔梗等。葛根，為豆科植物野葛的干燥根，習(xí)稱野葛，有解肌退熱、透疹、生津止渴、升舉清陽(yáng)之功。葛根是臨床預(yù)防心腦血管疾病的常用藥物，且實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)其抗腦缺血的藥理作用[9,10]。葛根是陽(yáng)明胃經(jīng)的引經(jīng)藥，實(shí)驗(yàn)研究[11]表明隨著葛根濃度的升高，食管癌細(xì)胞水通蛋白1表達(dá)也上調(diào)，可使其他藥物容易進(jìn)入靶部位來增強(qiáng)療效，發(fā)揮治療作用。

地龍是我國(guó)重要的中藥材之一，李時(shí)珍在《本草綱目》稱之具有通經(jīng)活絡(luò)、活血化瘀等作用。文獻(xiàn)[12,13]報(bào)道，地龍可以提高腦缺血再灌注損傷后腦組織SOD、GSH-PX活性，降低Caspase-3活性，清除自由基、炎癥細(xì)胞因子、減輕氧應(yīng)激損傷及抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡等作用。本研究顯示，B組SOD活性增加，MDA、LDH含量降低，相對(duì)梗死體積最小，且較單用地龍或葛根效果好，說明地龍與引經(jīng)藥葛根配伍具有協(xié)同作用。雖然A組各指標(biāo)與其他組的差異不如B組，但仍優(yōu)于單藥組。提示通過兩藥聯(lián)合應(yīng)用，能更加有效地清除機(jī)體內(nèi)氧自由基，避免細(xì)胞氧化性損傷，減少腦組織缺血性損害，降低腦部細(xì)胞的損傷程度。這可能與葛根引藥效入陽(yáng)明經(jīng)，引導(dǎo)地龍藥效的充分發(fā)揮有關(guān)。因此，通過對(duì)地龍與引經(jīng)藥葛根合用的藥理作用研究，為現(xiàn)代臨床應(yīng)用引經(jīng)理論預(yù)防腦缺血再灌注損傷提供一種重要思路與依據(jù)。

[1] 何春曉,張貝貝,鄭蕾,等.引經(jīng)藥醋柴胡對(duì)索拉非尼在大鼠血液和肝臟中藥物濃度的影響[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2016,43(6):62-65.

[2] 趙明.陽(yáng)明經(jīng)取穴法針刺配合康復(fù)療法治療中風(fēng)后遺癥50例[J].河南中醫(yī),2010,30(7):703.

[3] 張丹莉.針刺陽(yáng)明經(jīng)功能的影響[J].中國(guó)臨床康復(fù),2005,9(13):148.

[4] 張洪清,鄢燕,李艷華.針刺陽(yáng)明經(jīng)治療腦外傷偏癱[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,30(8):54-55.

[5] Diaz-RuizA, Zavala C, Montes S, et al. Antioxidant, antiinflammatory and antiapoptotic effects of dapsone in a model of brain ischemia/reperfusion in rats[J]. Neurosci Res, 2008,86(15):3410-3419.

[6] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats[J]. Stroke, 1989,20(1):84-91.

[7] 方向華,王淳秀,梅利平,等.腦卒中流行病學(xué)研究進(jìn)展[J].中華流行病學(xué)雜志,2015,32(9):847-850.

[8] 王光勝.腦缺血/再灌注損傷機(jī)制研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2011,17(24):3753-3756.

[9] Zhou F, Wang L, Liu P, et al. Puerarin protects brain tissue against cerebral ischemia/reperfusion injury by inhibiting the inflammatory response[J]. Neural Regen Res, 2014,9(23):2074-2080.

[10] Liu X, Mei Z, Qian J, et al. Puerarin partly counteracts the inflammatory response after cerebral ischemia/reperfusion via activating the cholinergic anti-inflammat ory pathway[J]. Neural Regen Res, 2013,8(34):3203-3215.

[11] 姜孝芳,李卉,李秀梅,等.中醫(yī)引經(jīng)藥葛根對(duì)食管癌細(xì)胞系TE-1及ECA109 AQP1 mRNA表達(dá)的影響[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,34(3):260.

[12] 李青,肖移生,侯吉華,等.地龍抗大鼠大腦局灶性腦缺血誘導(dǎo)的凋亡研究[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,22(2):66.

[13] 肖移生,侯吉華,伍慶華,等.地龍對(duì)大鼠大腦局灶性腦缺血損傷保護(hù)作用研究[J].中藥藥理與臨床,2009,25(6):64.

山東省高等學(xué)校科技計(jì)劃項(xiàng)目(J13LK52)；山東中醫(yī)藥大學(xué)2015年度國(guó)家級(jí)大學(xué)生研究訓(xùn)練計(jì)劃(SRT)項(xiàng)目(201510441076)。

楊瑩(E-mail: yangying2245@126.com)，宋 小 莉(E-mail: sxlbwd@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.013

R743.31

A

1002-266X(2016)15-0041-03

2015-12-03)