痤瘡患者血清H2S水平檢測及與IL-6和TNF-α水平的相關性

王　玉　黃　霞　余晶晶，2

痤瘡患者血清H2S水平檢測及與IL-6和TNF-α水平的相關性

王玉1黃霞1余晶晶1，2

目的：檢測痤瘡患者血漿H2S水平及確定與IL-6和TNF-α水平的相關性。方法：采用亞甲基染色法檢測67例痤瘡患者（輕度31例、中度21例、重度15例）及20名健康體檢者血清H2S水平，ELISA檢測血清IL-6和TNF-α水平。結果： 痤瘡患者血清H2S平均水平為（13.79±4.19）μmmol/L，顯著低于對照組的（22.23±4.52）μ mmol/L（P＜0.001）；血清IL-6及TNF-α平均水平分別為（89.72±31.68）pg/mL及（61.17±23.81）pg/mL，高于對照組的（27.32±4.26）pg/mL和（22.73±14.33 pg/ mL）（P＜0.001）。痤瘡患者血漿H2S水平與IL-6和TNF-α濃度均呈顯著負相關（均P＜0.001）。結論：血漿H2S可能參與痤瘡炎癥的發病過程。

痤瘡； 硫化氫； IL-6； TNF-α

痤瘡是最常見的慢性炎癥性毛囊皮脂腺疾病，大量實驗和臨床資料都表明，炎癥反應在痤瘡發病機制中扮演著重要的作用［1，2］。痤瘡丙酸桿菌釋放許多炎癥趨化因子，吸引了淋巴細胞、中性粒細胞和巨嗜細胞等炎癥細胞在局部的聚集，誘導局部炎癥反應和機體免疫反應［3，4］，其詳細的機制尚不清楚。內源性硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是一種最新發現的氣體信號分子，新的研究顯示H2S參與炎癥反應［5，6］。本研究擬通過檢測痤瘡患者血漿H2S、IL-6和TNF-α的含量，觀察H2S在痤瘡中的生成變化，探討H2S變化與炎癥介質的相關性，為痤瘡發病提供新的理論依據和治療靶點。

1　資料與方法

1.1臨床資料 選擇2013年9月至2014年9月在本科就診尚未經過治療的痤瘡患者67例，年齡16～35歲，男女不限；痤瘡嚴重程度參照Pillsbury分類法并略做修改［7］，即將III度和IV度合并為重度組，將患者分為三組即輕度組31例、中度組21例和重度組15例。排除自身免疫性、藥物性及系統性使用糖皮質激素等藥物的疾病患者。收集正常健康體檢者20名作為正常對照組。本實驗經本院倫理委員會審核通過。研究對象簽署知情同意書。四組人員年齡、性別等無顯著性差異（P＞0.05）。

主要試劑 人IL-6和TNF-α雙抗體夾心酶聯免疫試劑盒由檢測試劑由美國R&D Systems Inc生產，北京瑞爾欣德生物工程有限公司分裝。NaHS購自sigma公司。余為市售化學分析純。

1.2方法

1.2.1標本采集及處理 痤瘡組和健康體檢正常人均于早晨空腹時采肘靜脈血2～3 mL于肝素抗凝管中，低溫離心10 min（3000 r/min），吸取上清液，EP管密封分裝2份置-70℃冰箱保存待檢。

1.2.2血漿H2S檢測 應用亞甲基藍法測定血漿硫化氫［8］。將100 μL血漿加入含5%醋酸鋅100 μL的EP管中，充分混勻后加入100 μL NaOH（5 mol/L）。4℃離心10 min（12000 g）。小心吸去上清，加入500 μL去離子水沖洗，4℃離心10 min（12000 g），吸棄上清，依次加入5%醋酸鋅溶液100 μL，0.2%N，N二甲基對苯二胺100 μL，20%三氯乙酸100 μL，充分混勻后4℃離心5 min（12000 g）。取上清200 μL，加10%硫酸鐵銨10 μL，充分振蕩，靜置5～15 min。取200 μL溶液于96孔板，根據光譜掃描結果于665 nm測定其吸光度。根據標準曲線換算溶液中H2S濃度。

1.2.3IL-6和TNF-α檢測 應用人IL-6和TNF-α酶聯免疫試劑盒（美國R&D Systems Inc.）測定血漿標本中的IL-6和TNF-α，按說明書操作。

1.2.4統計學方法 所有數據均以均數±標準差（-x± s）表示，數據處理及制圖采用GraphPad Prism 5 Demo統計軟件分析，兩組間比較采用不配對t檢驗，多組間采用方差檢驗，相關性關系用Pearson相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1痤瘡患者血漿H2S水平的變化 本實驗條件下，正常對照組血漿H2S濃度是（22.23±4.52）μmmol/L，痤瘡患者血漿H2S水平顯著降低（13.79± 4.19）μmmol/L，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.001）。痤瘡患者輕度組、中度組及重度組血漿H2S濃度分別是（18.04±4.24）μmmol/L，（11.65±2.03）μmmol/L和（10.03±3.19）μmmol/L。各組血漿H2S濃度均顯著低于對照組，差異有統計學意義（均P＜0.001）。輕度組顯著高于中度組及重度組，差異有統計學意義（均P＜0.001）。結果見圖1、2。

2.2痤瘡患者血清中IL-6及TNF-α水平 痤瘡組及輕度組、中度組和重度組患者血清IL-6及TNF-α水平均顯著高于對照組，差異有統計學意義（均P＜0.01）。重度組血清IL-6及TNF-α水平又顯著高于輕度組及中度組（均P＜0.01），結果見表2。

圖1　痤瘡患者血漿H2S水平的變化

圖2　不同嚴重程度痤瘡患者血漿H2S水平比較

表1　對照組和痤瘡組血清IL-6和TNF-α比較（-x±s，pg/mL）

2.3痤瘡患者血漿H2S水平與IL-6和TNF-α相關性分析 痤瘡患者血漿H2S濃度與IL-6呈顯著負相關（R=-0.45，P＜0.01），與TNF-α呈顯著負相關（R=-0.51，P＜0.001）。

3　討論

痤瘡是一種慢性炎癥反應性疾病，其炎癥是丙酸桿菌及皮脂分解產物導致機體免疫應答作用的結果。痤瘡丙酸桿菌刺激角質細胞產生前炎癥因子如IL-6、IL-8和TNF-α等是啟動機體免疫應答反應的關鍵［3，9］。H2S是新發現的內源性氣體信號分子，近年的研究顯示H2S在調節機體生理功能等多個方面具有與NO及CO極為相似的特性［10］。隨著對H2S深入的研究和探討，發現H2S參與多種炎癥疾病的病理生理過程［11］。然而，H2S是否也參與了痤瘡的發病尚不清楚。

本文檢測了67例痤瘡患者血漿H2S及IL-6和TNF-α濃度，并分析患者血漿H2S水平與IL-6和TNF-α濃度的相關性。結果顯示，輕度組、中度組及重度組痤瘡患者血漿H2S濃度均顯著低于對照組，且與疾病嚴重程度相關；各組患者血清中IL-6和TNF-α濃度顯著高于對照組。說明H2S，IL-6和TNF-α參與了痤瘡的發病過程。國內外文獻均證實痤瘡患者血漿IL-6和TNF-α水平升高，參與了痤瘡發病的病理生理過程［3］。痤瘡患者血漿H2S水平降低的原因尚不清楚。伍蕊等檢測支氣管哮喘患者血漿H2S濃度發現，無論是哮喘緩解期或是急性發作期中輕度、中度和重度組的血漿H2S水平均較對照組降低［12］。然而，黃驚鴻發現重癥急性胰腺炎患者血漿H2S水平較對照組顯著增加［14］。斯偉宏等也發現急性腹膜炎患者血漿H2S水平較對照組也顯著增加［14］。H2S在不同炎癥疾病中的不同變化的原因尚不清楚，有學者認為H2S氣體信號分子的生物活性效應及其機制可能具有細胞和疾病特異性［15］。

本研究還發現，血漿H2S水平與IL-6和TNF-α水平呈顯著負相關。痤瘡發病時，H2S的生成變化與IL-6和TNF-α之間的關系尚不清楚。有文獻報道H2S可能作為一種炎癥介質，誘導中性粒細胞凋亡、抑制內皮黏附分子及淋巴細胞表達方式而參與炎癥因子介導的感染性疾病的發生與發展［16］。另有研究發現，外源性給予NaHS，能夠降低TNF-α誘導的細胞黏附分子（ICAM-1）和血管細胞黏附分子（VcAM-1）基因表達水平，減輕TNF-α誘導的血管內皮細胞炎癥信號和功能障礙［17，18］；減少心肌缺血再灌注損傷大鼠的核因子-κBp65從細胞質到細胞核的亞基易位，降低心肌細胞間黏附分子基因表達和多形核白細胞積聚，降低心肌組織白（細胞）介素6、TNF-α和髓過氧化酶活性［16，19］。釋放H2S的5-氨基水楊酸衍生物ATB-429能減輕小鼠結腸炎模型中的白細胞滲出。痤瘡發病時H2S生成減少是否導致炎癥因子增加而促進了痤瘡的炎癥過程，需進行深入研究。

總之，目前關于內源性H2S對痤瘡的生物學效應以及在皮膚炎癥性疾病中的作用研究甚少。增加H2S的生成是否能夠治療或緩解痤瘡等局部炎癥性皮膚疾病需要進一步的研究。

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（收稿:2015-09-05 修回:2015-10-20）

Detection of hydrogen sulfide and its correlation with interleukin 6 and tumor necrosis factor-α in patients with acne

WANG Yu1，HUANG Xia1，YU Jingjing1，2.
1.Department of Dermatology，Shiyan People's Hospital，Hubei 442000，China；2.Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，China
Corresponding author:YU Jingjing，E-mail:13317283066@163.com

Objective:To detect the level of hydrogen sulfide（H2S）and to determine the relationship between serum H2S level and the levels of IL-6 and TNF-α among the patients with acne vulgaris.Methods: The level of H2S in 67 patients with acne vulgaris（31 patients with mild acne，21 with moderate acne and 15 with severe acne）and 20 normal controls was detected by methylene blue staining.The level of IL-6 and TNF -α were detected by ELISA.Results:The average level of H2S in the patients with acne was（13.79±4.19）μmmol/L，which was lower than that in controls（22.23±4.52）μmmol/L.The average levels of IL-6 and TNF-α were（89.72±31.68）pg/mL and（61.17±23.81）pg/mL，which was higher than those in controls（27.32±4.26）pg/mL and（22.73±14.33）pg/mL.The H2S level of patients was negatively correlated with the levels of IL-6 and TNF-α（P＜0.001）.Conclusion:H2S may be associated with the inflammation reaction in the course of acne.

acne；hydrogen sulfide；IL-6；TNF-α

1湖北省十堰市人民醫院皮膚科，442000 2湖北醫藥學院，442000

余晶晶，E-mail:13317283066@163.com