Toll樣受體4與胰腺癌PANC1細胞對吉西他濱敏感性的關系

孫運良　虞陽　童依麗　吳洪玉　馬建霞

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Toll樣受體4與胰腺癌PANC1細胞對吉西他濱敏感性的關系

孫運良虞陽童依麗吳洪玉馬建霞

目的觀察Toll樣受體4(TLR4)與胰腺癌PANC1細胞對吉西他濱(GEM)敏感性的關系，探討其相關機制。 方法將PANC1細胞分為GEM組、脂多糖(LPS)+GEM組、TLR4-siRNA+GEM組。GEM組給予GEM處理，LPS+GEM組先用1 mg/L的LPS干預4 h后再用GEM處理，TLR4-siRNA+GEM組先用100 pmol/ml TLR4-siRNA轉染細胞4 h后再用GEM處理。以不做任何處理的細胞作為對照組。采用MTT法檢測各組細胞的增殖，Hoechst33258染色觀察細胞形態學變化，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，蛋白質印跡法檢測細胞TLR4、磷酸化AKT(p-AKT)、活性Caspase-3蛋白表達。結果GEM組、LPS+GEM組、TLR4-siRNA+GEM組GEM對PANC1細胞的半數抑制濃度(IC50)分別為(8.90±0.62)、(14.21±0.95)、(3.96±0.27)mg/L，LPS+GEM組顯著高于GEM組，TLR4-siRNA+GEM組顯著低于GEM組，差異均有統計學意義(P值均<0.01)。LPS+GEM組典型凋亡形態學改變的細胞數較GEM組減少，而TLR4-siRNA+GEM組則較GEM組增多；對照組、GEM組、LPS+GEM組、TLR4-siRNA+GEM組細胞凋亡率分別為(2.1±0.3)%、(15.1±2.3)%、(9.8±1.5)%、(22.9±3.1)%，LPS+GEM組顯著低于GEM組，TLR4-siRNA+GEM組顯著高于GEM組，差異均有統計學意義(P值均<0.01)。4組的TLR4表達量分別為0.83±0.08、0.81±0.07、0.85±0.07、0.16±0.03；p-AKT表達量為0.61±0.05、0.36±0.03、0.73±0.07、0.21±0.02；活性Caspase-3表達量為0.66±0.05、0.73±0.07、0.45±0.04、0.91±0.07。TLR4-siRNA+GEM組的TLR4、p-AKT表達均較GEM組顯著下降(P值均<0.01)，而活性Caspase-3表達顯著增高(P<0.05)。LPS+GEM組的p-AKT表達較GEM組顯著增加(P<0.01)，而活性Caspase-3蛋白表達顯著減少(P<0.01)。結論TLR4可抑制胰腺癌PNAC1細胞對GEM的敏感性，其機制可能與激活PI3K/AKT通路，下調活性Caspase-3表達有關。

胰腺腫瘤；Toll樣受體4；抗藥性，腫瘤；吉西他濱；磷酸化AKT；活性Caspase-3

Fund program：Excellent Youth Physicians of Shanghai HuaDong Hospital(HDGG2014003)；Scientific Research Project of Lianyungang Municipal Planning Commission(1427)

吉西他濱(gemcitabine，GEM)是目前治療中晚期胰腺癌的一線化療藥物，但胰腺癌是耐藥性很強的腫瘤，GEM單藥治療對延長胰腺癌患者生存期的效果并不令人滿意[1-3]，因此從分子水平上研究胰腺癌化療耐藥的相關機制，尋找新的治療靶點，以期提高胰腺癌的化療敏感性受到了學者的廣泛關注。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)已被證實在腫瘤細胞呈高表達，與多種腫瘤的發生、發展密切相關[4-5]。近年來的研究還表明，TLR4的異常表達參與腫瘤細胞的化療耐藥[6-8]。本課題組前期研究發現TLR4在胰腺癌呈高表達，且與胰腺癌的侵襲和轉移有關[9]。但有關TLR4是否參與胰腺癌對吉西他濱化療耐藥的研究較少。本研究通過TLR4的配體脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)干預及采用特異性siRNA沉默TLR4基因表達的方法觀察胰腺癌PANC1細胞對GEM敏感性的變化，并探討相關機制。

材料和方法

一、材料

人胰腺癌細胞株PANC1購自美國ATCC公司。GEM為法國Llilly公司產品，PBS稀釋后備用。LPS為Sigma公司產品。靶向TLR4的siRNA(TLR4-siRNA)正義序列5′-CUUUAUCCAACCAGGUGCAUUUU-3′，反義序列5′-AAUGCACCUGGUUGGAUAAAGUU-3′，由上海吉瑪生物技術有限公司合成。Hoechst 33258、AnnexinV FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇碧云天公司。磷酸化AKT(p-AKT)單抗為美國Cell Signaling Technology公司產品，抗TLR4、活性Caspase-3(經過系列反應被激活的Caspase為活性Caspase)多抗購自Santa Cruz公司。

二、方法

1．細胞培養及TLR4-siRNA轉染：PANC1細胞置含有10% FBS、青霉素及鏈霉素各100 U/ml的DMEM培養液中在37℃、5% CO2條件下培養、傳代。取對數生長期細胞，以每孔1×106個細胞加入6孔板，培養過夜待細胞貼壁。將100 pmol TLR4-siRNA加入到100 μl的無血清DMEM培養液混勻，用100 μl無血清DMEM加5 μl lipofectamin2000輕輕混勻后室溫放置5 min，將稀釋好的TLR4-siRNA、lipofectamin2000試劑輕柔混勻后室溫放置20 min以形成TLR4-siRNA/lipofectamin復合物。棄去6孔板各孔培養液，加入200 μl TLR4-siRNA/lipofectamin復合物和800 μl無血清DMEM培養液繼續培養4 h以獲取轉染TLR4-siRNA的PANC1細胞。

2．MTT法檢測細胞增殖：收集對數生長期PANC1細胞，以每孔5×103個細胞加入96孔板。待細胞貼壁后更換為無血清的DMEM培養液。實驗分為GEM組、LPS+GEM組、TLR4-siRNA+GEM組，每組6個復孔。GEM組分別加入終濃度為0.01、0.1、1、10 mg/L的GEM；LPS+GEM組先用1 mg/L的LPS干預細胞4 h，棄去培養液，再分別加入上述不同濃度的GEM； TLR4-siRNA+GEM組先用100 pmol/ml的TLR4-siRNA轉染細胞4 h，棄去培養液，再分別加入上述不同濃度的GEM。以不做任何處理的PANC1細胞作為對照組。各組細胞常規培養48 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(5mg/ml)繼續培養4 h，吸去孔內培養液，每孔加入150 μl DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，上酶聯免疫檢測儀測各孔在波長570 nm處的吸光度值(A570值)。細胞生長抑制率=1-(實驗組A570值/對照組A570值)×100%。實驗重復3次，取均值。

3．Hoechst33258染色法觀察細胞形態變化：取對數生長期PANC1細胞，以每孔5×105個細胞接種于6孔板，待細胞貼壁后同樣分為上述3組，但GEM濃度只有1 mg/L，以不做任何處理的細胞作為對照組。培養24 h后棄去培養液，PBS洗滌3次，用4%多聚甲醛溶液固定10 min，PBS沖洗細胞3次，加入Hoechst33258室溫避光染色10 min，置熒光顯微鏡下觀察細胞形態變化。

4．流式細胞儀檢測細胞凋亡：取上述培養24 h的4組細胞，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。嚴格按Annexin V-FITC試劑盒說明書操作。

5．蛋白質印跡法檢測細胞TLR4、p-AKT、活性Caspase-3蛋白表達：取上述培養24 h的4組細胞，用RIPA細胞裂解液裂解細胞，提取各組細胞總蛋白，應用蛋白分析系統(Bio-Rad)測定蛋白濃度，常規行蛋白質印跡法檢測蛋白表達，以β-actin為內參。抗TLR4、p-AKT、Caspase-3抗體工作濃度1∶500，辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗工作濃度1∶5 000，最后ECL發光，X片曝光、顯影、定影。應用凝膠圖像軟件分析系統對膠片掃描，以目的條帶與內參條帶灰度值比表示蛋白相對表達量。

三、統計學處理

結　　果

一、各組PANC1細胞增殖的變化

隨著GEM濃度的增加，LPS+GEM組對PANC1細胞抑制率較GEM組顯著下降，而TLR4-siRNA+GEM組的抑制率較GEM組顯著增高，差異均有統計學意義(P<0.05或<0.01，圖1)。GEM組、LPS+GEM組、TLR4-siRNA+GEM組GEM對PANC1細胞的半數抑制濃度(IC50)分別為(8.90±0.62)、(14.21±0.95)、(3.96±0.27)mg/L，LPS+GEM組顯著高于GEM組，TLR4-siRNA+GEM組顯著低于GEM組，差異均有統計學意義(t=11.438，P<0.01；t=17.927，P<0.01)。

圖1　GEM組、LPS+GEM組、TLR4-siRNA+GEM組PANC1細胞的生長抑制率曲線

二、各組PANC1細胞凋亡的變化

熒光顯微鏡下對照組細胞未見明顯凋亡的形態學改變；GEM組、LPS+GEM組、TLR4-siRNA+GEM組細胞均出現不同程度的細胞核濃縮以及凋亡小體形成等典型的細胞凋亡形態學改變。LPS+GEM組典型凋亡形態學改變的細胞數較GEM組減少，而TLR4-siRNA+GEM組則較GEM組增多(圖2)；對照組、GEM組、LPS+GEM組、TLR4-siRNA+GEM組細胞凋亡率分別為(2.1±0.3)%、(15.1±2.3)%、(9.8±1.5)%、(22.9±3.1)%。LPS+GEM組細胞凋亡率較GEM組顯著減少，而TLR4-siRNA+GEM組較GEM組顯著增加，差異均有統計學意義(t=3.384，P<0.05；t=4.451，P<0.01，圖3)。

圖2　對照組(2A)、GEM組(2B)、LPS+GEM組(2C)、TLR4-siRNA+GEM組(2D)PANC1細胞的形態變化(熒光顯微鏡　×200)

圖3　對照組(3A)、GEM組(3B)、LPS+GEM組(3C)、TLR4-siRNA+GEM組(3D)PANC1細胞的凋亡

三、各組PANC1細胞TLR4、p-AKT、活性Caspase-3蛋白表達的變化

對照組、GEM組、LPS+GEM組、TLR4-siRNA+GEM組細胞TLR4表達量分別為0.83±0.08、0.81±0.07、0.85±0.07、0.16±0.03；p-AKT表達量為0.61±0.05、0.36±0.03、0.73±0.07、0.21±0.02；活性Caspase-3表達量為0.66±0.05、0.73±0.07、0.45±0.04、0.91±0.07(圖4)。TLR4-siRNA+GEM組的TLR4、p-AKT蛋白表達均較GEM組顯著下降，活性Caspase-3蛋白表達顯著增高(t=16.304，P<0.01；t=7.273，P<0.05；t=2.935，P<0.01)； LPS+GEM組p-AKT蛋白表達較GEM組顯著增加，活性Caspase-3蛋白表達顯著減少(t=8.748，P<0.01；t=5.852，P<0.01)，而TLR4蛋白表達與GEM組間的差異無統計學意義。

討　　論

TLRs是Toll基因所編碼的一類跨膜受體蛋白，其中TLR4是目前研究相對較為成熟的TLR家族成員。在TLR4信號轉導途徑中，LPS是TLR4的配體，它可識別并結合TLR4，進而產生信號轉導，誘導宿主發生免疫防御反應。目前的研究證實，TLR4除了在免疫細胞表達外，還在腫瘤細胞高表達，與結腸癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤的發生、發展密切相關。Wang等[4]報道，TLR4在肝癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織，且LPS能夠促進肝癌細胞株HL-7702、PLC/PRF/5的增殖。Hsu等[5]報道，TLR4在結腸癌細胞中顯著高表達，且與腫瘤細胞的肝轉移密切相關。

圖4　對照組(1)、GEM組(2)、LPS+GEM組(3)、TLR4-siRNA+GEM組(4)PANC1細胞TLR4、p-AKT、活性Caspase-3蛋白表達

近年來，越來越多的的證據表明，TLR4的異常表達除了與腫瘤的發生、發展有關，還參與多種腫瘤細胞對化療藥物的耐藥作用。Zhang等[6]報道，通過LPS激活TLR4表達后，前列腺癌細胞PC-3對多西他賽的化療敏感性明顯下降；而通過siRNA干擾下調TLR4表達后，PC-3細胞對多西他賽的化療敏感性顯著增高。Sun等[7]的研究結果表明，TLR4在人口腔鱗狀細胞癌組織中高表達，且高表達的TLR4與口腔鱗狀細胞癌對順鉑的化療耐藥有關。此外有研究證實，紫杉醇也是TLR4的重要配體，它可通過激活TLR4信號通路，誘導多種細胞因子及抗凋亡分子表達增加，從而降低腫瘤細胞對紫杉醇的化療敏感性[8]。本研究結果顯示，經LPS激活TLR4后，GEM對PANC1細胞的IC50顯著升高，而凋亡細胞數和細胞凋亡率顯著下降；應用TLR4-siRNA沉默TLR4表達后，GEM對PANC1細胞的IC50顯著降低，而凋亡細胞數和細胞凋亡率顯著增加，同樣表明TLR4可抑制胰腺癌細胞對GEM的敏感性。

PI3K/AKT通路廣泛存在于各種細胞，是參與細胞生長、增殖、分化調節的信號轉導通路。AKT是PI3K下游直接的靶蛋白，具有絲氨酸/蘇氨酸殘基，可直接被PI3K激活；p-AKT是AKT的功能活化狀態。目前已證實，PI3K/AKT通路在多種腫瘤細胞內呈持續激活狀態，持續激活的PI3K/AKT通路可誘導VEGF以及IL-8等細胞因子的產生，從而促進腫瘤發生與發展。經LPS激活TLR4蛋白后可促進AKT的磷酸化，激活PI3K/AKT通路，促進腫瘤細胞的生長；而使用RNA干擾技術沉默TLR4基因表達后可抑制PI3K/AKT通路，促進腫瘤細胞的凋亡[10-12]。本研究結果顯示，LPS+GEM組胰腺癌PANC1細胞p-AKT的表達較GEM組顯著增加，而TLR4-siRNA+GEM組在抑制TLR4表達的同時導致p-AKT表達較GEM組顯著減少，提示TLR4具有激活胰腺癌細胞PI3K/AKT通路的作用。

Caspase是一類半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，通常以無活性的酶原形式存在于細胞胞質中，經過系列反應被激活后可參與切割細胞內多種底物，從而導致細胞凋亡。活化的Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡執行者之一，是細胞凋亡過程中的主要效應因子。研究顯示，抑制Caspase-3活化是PI3K/AKT促腫瘤的重要機制；阻斷PI3K/AKT通路可上調活性Caspase-3表達，促進腫瘤細胞凋亡，從而達到抑制腫瘤細胞生長的目的[13]。本研究結果顯示，與GEM組相比，LPS+GEM組活性Caspase-3表達顯著減少， TLR4-siRNA+GEM組活性Caspase-3表達則顯著增加，提示TLR4具有抑制Caspase-3活化的作用，其機制可能與激活PI3K/AKT通路有關。

總之，異常表達的TLR4在胰腺癌PNAC1細胞對GEM的化療耐藥過程中起重要作用，其機制與激活PI3K/AKT通路，抑制Caspase-3活化有關。

[1]Von Hoff DD, Ramanathan RK, Borad MJ, et al. Gemcitabine plus nab-paclitaxel is an active regimen in patients with advanced pancreatic cancer: a phase I/II trial[J]. J Clin Oncol, 2011, 29(34): 4548-4554. DOI: 10.1200/JCO.2011.36.5742.

[2]張太平,曹喆,趙玉沛.胰腺癌的化療與放療[J].中華消化外科雜志,2015,14(8):619-622.DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-9752.2015.08.006.

[3]楊尹默.胰腺癌外科治療的熱點與難點[J].中華消化外科雜志,2015,14(8):612-614.DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-9752.2015.08.004.

[4]Wang L, Zhu R, Huang Z, et al. Lipopolysaccharide-induced toll-like receptor 4 signaling in cancer cells promotes cell survival and proliferation in hepatocellular carcinoma[J]. Dig Dis Sci, 2013, 58(8): 2223-2236. DOI: 10.1007/s10620-013-2745-3.

[5]Hsu RY, Chan CH, Spicer JD, et al. LPS-induced TLR4 signaling in human colorectal cancer cells increases beta1 integrin-mediated cell adhesion and liver metastasis[J]. Cancer Res, 2011, 71(5): 1989-1998. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-10-2833.

[6]Zhang Y, Wang Y, Yuan J, et al. Toll-like receptor 4 ligation confers chemoresistance to docetaxel on PC-3 human prostate cancer cells[J]. Cell Biol Toxicol, 2012, 28(4): 269-277. DOI: 10.1007/s10565-012-9221-2.

[7]Sun Z, Luo Q, Ye D, et al. Role of toll-like receptor 4 on the immune escape of human oral squamous cell carcinoma and resistance of cisplatin-induced apoptosis[J]. Mol Cancer, 2012, 11:33. DOI: 10.1186/1476-4598-11-33.

[8]Rajput S, Volk-Draper LD, Ran S. TLR4 is a novel determinant of the response to paclitaxel in breast cancer[J]. Mol Cancer Ther, 2013, 12(8):1676-1687. DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-12-1019.

[9]孫運良, 滿曉華, 王麗華, 等. Toll樣受體-4與胰腺癌侵襲和轉移的關系[J]. 中國癌癥雜志, 2012, 22(7): 522-527. DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2012.05.008.

[10]Li D, Jin Y, Sun Y, et al. Knockdown of toll-like receptor 4 inhibits human NSCLC cancer cell growth and inflammatory cytokine secretion in vitro and in vivo[J]. Int J Oncol, 2014,45(2):813-821. DOI: 10.3892/ijo.2014.2479.

[11]Doan HQ, Bowen KA, Jackson LA, et al. Toll-like receptor 4 activation increases Akt phosphorylation in colon cancer cells[J]. Anticancer Res, 2009, 29(7):2473-2478.

[12]Wu Y, Zhao Q, Peng C, et al. Neutrophils promote motility of cancer cells via a hyaluronan-mediated TLR4/PI3K activation loop[J]. J Pathol, 2011, 225(3):438-447. DOI: 10.1002/path.2947.

[13]Yang ZP, Zhao Y, Huang F, et al. Equol inhibits proliferation of human gastric carcinoma cells via modulating Akt pathway[J]. World J Gastroenterol, 2015, 21(36):10385-10399. DOI: 10.3748/wjg.v21.i36.10385.

(本文編輯：屠振興)

Relationship between TLR4 and the sensitivity of pancreatic cancer PANC1 cells to gemcitabine

SunYunliang,YuYang,TongYili,WuHongyu,MaJianxia.

DepartmentofGastroenterology,ThePeople′sHospitalofGanyuCounty,Lianyungang222100,China

Correspondingauthor:MaJianxia,Email:yz_mjx@163.com

ObjectiveTo observe the relationship between Toll-like receptor 4 (TLR4) and the sensitivity of PANC1 cells to gemcitabine (GEM), and to analyze the potential mechanism. MethodsPANC1 cells were divided into GEM group, lipopolysaccharide (LPS)+GEM group and TLR4-siRNA+GEM group. GEM group was treated by GEM alone. LPS+GEM group was pretreated with 1 mg/L LPS for 4 h and then treated by GEM. TLR4-siRNA+GEM group was transfected with 100 pmol/mL TLR4-siRNA for 4 h and then treated by GEM. The untreated cells were used as the control group. MTT method was used to detect the cell proliferation. Morphological changes and apoptosis rate of the cells were examined by Hoechst33258 staining and flow cytometry, respectively. The protein expression of TLR4, phosphorylated AKT (p-AKT) and activated Caspase-3 were detected by Western blot. ResultsThe median inhibition concentration (IC50) of GEM in the GEM group, LPS+GEM group and TLR4-siRNA+GEM group was (8.9±0.32), (14.21±0.95), (3.96±0.27)mg/L, respectively. The IC50in LPS+GEM group was significantly higher than that in GEM group (P<0.01), and the IC50of GEM in TLR4-siRNA+GEM group was significantly lower than that in GEM group (P<0.01). Compared with that in GEM group, the cells with typical apoptotic morphological changes were decreased in LPS+GEM group, which was increased in TLR4-siRNA+GEM group. The apoptotic rate in control group, GEM group, LPS+GEM group, TLR4-siRNA+GEM group was (2.1±0.3)%, (15.1±2.3)%, (9.8±1.5)%, (22.9±3.1)%, respectively. Compared with that in GEM group, the cells apoptotic rate was significantly reduced in LPS+GEM group (P<0.01), which was significantly increased in TLR4-siRNA+GEM group (P<0.01). TLR4 protein level in the 4 groups was 0.83±0.08, 0.81±0.07, 0.85±0.07 and 0.16±0.03; p-AKT protein level 0.61±0.05, 0.36±0.03, 0.73±0.07 and 0.21±0.02; activated Caspase-3 protein level was 0.66±0.05, 0.73±0.07, 0.45±0.04 and 0.91±0.07, respectively. The expression of TLR4 and p-AKT in TLR4-siRNA+GEM group was significantly lower than that in GEM group (P<0.01), while the expression of activated Caspase-3 protein was increased significantly (P<0.05). Compared with the GEM group, the expression of p-AKT protein in LPS+GEM group was significantly increased (P<0.01), and the expression of activated Caspase-3 protein was significantly decreased (P<0.01). ConclusionsTLR4 can inhibit the sensitivity of pancreatic cancer PNAC1 cells to GEM, and the mechanism is related to the activation of PI3K/AKT pathway and down-regulation of activated Caspase-3.

Pancreatic neoplasms;Toll-like receptor 4;Drug resistance, neoplasm;Gemcitabine;Phosphorylated AKT;Activated Caspase-3

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.04.003

222100江蘇連云港，江蘇省連云港市贛榆區人民醫院消化內科(孫運良)；上海復旦大學附屬華東醫院消化內科(虞陽、童依麗、馬建霞)；第二軍醫大學長海醫院消化內科(吳洪玉)

馬建霞，Email：yz_mjx@163.com

上海復旦大學華東醫院骨干基金(HDGG2014003)；連云港市衛計委科研項目(1427)

2016-01-25)