燈盞花素對胰島素抵抗大鼠骨骼肌脂肪酸代謝的影響*

張馨媛武莉李錦平趙棟梁閆瑞琴

燈盞花素對胰島素抵抗大鼠骨骼肌脂肪酸代謝的影響*

張馨媛①武莉②李錦平②趙棟梁①閆瑞琴②

目的：探討燈盞花素對胰島素抵抗大鼠骨骼肌脂質沉積及脂肪酸代謝的影響。方法：選取健康雄性SD大鼠40只，分為正常組10只和高脂高糖組30只，分別給予普通飼料和高脂高糖飼料，喂養12周后行葡萄糖耐量試驗，根據成模標準，篩選出成模大鼠30只，剔除4只狀態不佳和死亡大鼠，將其余26只大鼠分為模型組9只，燈盞花素高劑量組8只和燈盞花素低劑量組9只。燈盞花素高、低劑量組分別腹腔注射相應劑量的燈盞花素，正常組和模型組腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液，四組均給藥2周，2周后取所需組織進行各指標檢測。結果：模型組腹脂指數、空腹血糖（FBG）、空腹血清胰島素（FINS）、胰島素抵抗指數（IRI）、血清和組織內FFA、TG、脂滴面積/肌纖維總面積、光密度平均值、LccoAs含量及FAT/CD36均處于四組中最高，而CPT-1處于四組中最低。結論：12周高脂高糖喂養成功誘導IR大鼠模型，燈盞花素可明顯改善胰島素抵抗，改善骨骼肌脂質沉積，其作用可能與CPT-1表達的上調和FAT/CD36的表達下降有關。

燈盞花素； 胰島素抵抗； 長鏈脂酰輔酶A； 脂肪酸轉位酶； 肉脂酰轉移酶

First-author's address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030000，China

脂肪酸代謝異常在胰島素抵抗的發生、發展中扮演重要角色?！爸拘詫W說”認為：血液中過多的游離脂肪酸（free fatty acid，FFA），以甘油三酯（triglyceride，TG）形式儲存于非脂肪組織（骨骼肌、肝臟等），導致脂質異位沉積性疾?。?］。病理狀態下，FFA和TG過多積聚導致骨骼肌對胰島素敏感性降低，而出現胰島素抵抗（insulin resistance，IR）［2］。脂肪酸轉位酶（fatty acid translocation enzyme，FAT/CD36）是長鏈脂肪酸轉運入細胞必須的酶，在脂肪酸攝取中起關鍵作用；肉堿脂酰轉移酶（carnitine palmityl transferase，CPT-1）為線粒體脂肪酸氧化限速酶，張雪梅等［3］研究顯示高果糖誘導IR大鼠，FAT/CD36、CPT-1與IR密切相關。燈盞花素（breviscapine），又名燈盞細辛，臨床主要用于治療腦血栓，前期研究發現其對2型糖尿病及IR有一定影響［4］。本研究采用高脂高糖喂養，制備IR大鼠模型，觀察燈盞花素對骨骼肌脂質沉積的影響及對脂肪酸代謝相關蛋白的干預作用，旨在進一步探討燈盞花素改善IR作用及其機制，現報道如下。

1　材料與方法

1.1材料 健康雄性SD大鼠40只，清潔級，體重（220±20）g，購自山西醫科大學動物實驗中心（合格證書編號：100026）；燈盞花素注射液（運城石藥有限公司，批號：20140604）；大鼠胰島素（FINS）試劑盒、TG試劑盒、FFA試劑盒、長鏈脂酰輔酶A（LccoAs） ELISA試劑盒（南京建成生物有限公司）；FAT/CD36抗體（Santa Cruz公司）；CPT-1抗體（Santa Cruz公司）；引物設計（上海生工）。

1.2動物處理與分組 40只大鼠適應性喂養1周，隨機分為正常組10只和高脂高糖組30只，分別喂養普通飼料和高脂高糖飼料（配方：普通飼料50%，豬油30%，蔗糖12%，蛋黃8%）［5］。喂養12周后，行葡萄糖耐量實驗（葡萄糖2 g/kg，腹腔注射），尾靜脈采血測空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）及各時間點血糖、空腹血清胰島素（fasting serum insulin，FINS），以高脂高糖組各時間點血糖均明顯高于正常組及胰島素抵抗指數（insulin resistance index，IRI）與正常組有顯著性差異為成模標準［6］，高脂高糖組30只大鼠均成模，剔除4只狀態不佳和死亡大鼠，將其余隨機分為模型組9只，燈盞花素高劑量組8只和燈盞花素低劑量組9只。燈盞花素高、低劑量組分別腹腔注射200 mg/（kg·d）和100 mg/ （kg·d），燈盞花素，正常組和模型組腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液，四組均給藥2周，腹腔注射給藥2周，正常組、模型組給予等體積的生理鹽水。2周后進行腹主動脈采血，分離附睪及腎周脂肪組織并稱重，取股四頭肌組織，液氮保存備用。

1.3檢測指標

1.3.1腹脂指數、FBG、FINS、IRI的測定 14周末，尾靜脈采血并采用葡萄糖酶氧化法測定FBG，采用ELISA試劑盒于酶標儀上檢測FINS。IRI= （FBG×FINS）/22.5，腹脂指數=內臟脂肪重量（g）/體重（g）［7］。

1.3.2血清、骨骼肌中TG、FFA的檢測 取骨骼肌組織0.1 g，用90%的無水乙醇抽提，3500 rpm離心，取組織上清；另取-80 ℃血清，TG按照試劑盒測定、FFA采用銅試劑測定其銅離子含量推算其含量。

1.3.3油紅O染色 取OCT包埋骨骼肌組織，置于冰凍切片機，-25 ℃復溫20 min，冰凍切片8 μm，室溫放置10 min，油紅染色25 min，60%異丙醇染色5 min，蒸餾水清洗15 min，蘇牧素染核20 s，電子顯微鏡采集圖像，方法同夏同佳實驗［8］。

1.3.4ELISA測定骨骼肌LccoAs含量 取骨骼肌組織0.1 g，生理鹽水研磨抽提，按10∶1將樣品與緩沖液混合，于96孔板嚴格按照試劑盒操作。

1.3.5Western blot檢 測FAT/CD36、CPT-1蛋 白相對表達量 取骨骼肌組織0.1 g，加入1mL RIPA裂解液，冰上研磨，離心取上清。BCA測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉，一抗4 ℃過夜（FAT/CD36 1∶300，CPT-1∶1400），二抗37 ℃2 h （1∶8000），洗膜，暗室曝光。

1.3.6半定量PCR檢測FAT/CD36、CPT-1 mRNA相對含量 采用半定量PCR技術，用Trizol RNA抽提試劑盒，提取骨骼肌總RNA，利用試劑盒，逆轉錄成cDNA，采用PCR儀擴增，瓊脂糖跑膠，儀器采圖數據處理。引物序列：（1）actin 正義：gtc cct gta tgc ctc tgg tc，反義：acc gct cat tgc cga tag t；（2）CD36 正義：gtg ctg tcc ctg tgt t，反義：cag tga agg ctc aaa gat gg，產物片段為145 bp；（3）CPT-1正義：gcc act gat gaa gga aga aga，反義：cca gaa gac gaa tgg gtt tg，產物片段為132 bp。以actin為內參基因，采用捷達凝膠系統軟件計算目基因相對表達量。

1.4統計學處理 采用SPSS 17.0統計學軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析法（ANOVA），兩組間比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1大鼠腹脂指數、FBG、FINS、IRI變化比較 與正常組比較，模型組腹脂指數、FBG、FINS、IRI明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，燈盞花素高低劑量組腹脂指數、FBG、FINS、IRI均不同程度地降低（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組腹脂指數、FBG、FINS、IRI均不同程度地降低（P＜0.05），見表1。

表1　大鼠腹脂指數、FBG、FINS、IRI變化比較（）

表1　大鼠腹脂指數、FBG、FINS、IRI變化比較（）

*與正常組比較，P＜0.05；△與模型組比較，P＜0.05；#與燈盞花素低劑量組比較，P＜0.05

組別　腹脂指數　FBG（mmol/L）　FINS（mU/L）　IRI正常組（n=10）　0.05±0.02　4.44±0.21　45.31±2.75　9.50±1.05模型組（n=9）　0.11±0.05*　9.47±0.26*　60.54±4.01*　25.67±1.35*燈盞花素高劑量組（n=8）　0.04±0.03△#　5.23±0.16△#　45.60±3.02△#　11.04±3.04△#燈盞花素低劑量組（n=9）　0.06±0.06△　6.86±0.34△　55.13±3.63*△　17.79±2.07*△

*與正常組比較，P＜0.05；△與模型組比較，P＜0.05；#與燈盞花素低劑量組比較，P＜0.05

2.2大鼠血清、骨骼肌FFA、TG含量比較 與正常組比較，模型組血清、骨骼肌內FFA、TG均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，燈盞花素高低劑量組FFA、TG均有不同程度降低（P＜0.01）；與低劑量組比較，高劑量組血清、骨骼肌內FFA、TG均有不同程度降低（P＜0.05），見表2。

2.3油紅O染色結果比較 正常組細胞核呈藍色，胞質未出現紅色脂滴，見圖1；與正常組比較，模型組光密度平均值明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，燈盞花素高低劑量組脂滴面積/肌纖維總面積和光密度平均值均不同程度地降低，比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見表3。

2.4骨骼肌LccoAs結果比較 正常組LccoAs含量為（3.26±0.19）nmol/g、模型組為（7.18±0.17）nmol/g、燈盞花素高劑量組為（3.10±0.05）nmol/g、燈盞花素低劑量組為（4.95±0.05）nmol/g。與正常組比較，模型組含量明顯上升；與模型組比較，燈盞花素高低劑量組含量明顯降低；與低劑量組比較，高劑量組含量有所升高，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。

圖 1 各組大鼠骨骼肌油紅染色結果（×400）

表3　油紅0染色結果比較（）

表3　油紅0染色結果比較（）

*與正常組比較，P＜0.05；△與模型組比較，P＜0.05；#與燈盞花素低劑量組比較，P＜0.05

組別　脂滴面積/肌纖維總面積　光密度平均值正常組（n=10）　-　-模型組（n=9）　0.68±0.30*　1.57±0.28*燈盞花素高劑量組（n=8）　0.18±0.21*△#　0.68±0.14*△#燈盞花素低劑量組（n=9）　0.30±0.22*△　1.02±0.39*△

2.5FAT/CD36、CPT-1蛋白相對表達量比較 與正常組比較，模型組FAT/CD36表達明顯增加，CPT-1表達含量明顯減少，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，燈盞花素高低劑量組FAT/CD36表達均明顯降低，CPT-1表達水平均明顯升高，比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表4　FAT/CD36、CPT-1蛋白相對表達量比較（）

表4　FAT/CD36、CPT-1蛋白相對表達量比較（）

*與正常組比較，P＜0.05；△與模型組比較，P＜0.05；#與燈盞花素低劑量組比較，P＜0.05

組別　FAT/CD36　CPT-1正常組（n=10）　0.34±0.08　0.40±0.07模型組（n=9）　0.61±0.21*　0.28±0.03*燈盞花素高劑量組（n=8）　0.05±0.01*△#　0.66±0.15*△燈盞花素低劑量組（n=9）　0.19±0.13*△　0.70±0.04*△

2.6FAT/CD36、CPT-1 mRNA相對含量比較 與正常組比較，模型組FAT/CD36 mRNA含量明顯增加，而CPT-1的含量明顯減少，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，燈盞花素高低劑量組FAT/CD36 mRNA均降低，且高劑量組效果更明顯，而CPT-1 mRNA含量升高，比較差異均有統計學意義，（P＜0.05），見圖2和表5。

圖2　各組大鼠骨骼肌FAT/CD36、CPT-1的mRNA含量PCR檢測圖

表5　FAT/CD36、CPT-1 mRNA相對含量比較（）

表5　FAT/CD36、CPT-1 mRNA相對含量比較（）

*與正常組比較，P＜0.05；△與模型組比較，P＜0.05；#與燈盞花素低劑量組比較，P＜0.05

組別　FAT/CD36　CPT-1正常組（n=10）　1.60±0.15　2.02±0.05模型組（n=9）　2.40±0.64*　0.25±0.02*燈盞花素高劑量組（n=8）　0.56±0.13*△#　4.00±0.38*△#燈盞花素低劑量組（n=9）　0.73±0.05*△　3.33±0.06*△

3　討論

胰島素抵抗（IR）被認為各種代謝性疾病的核心，其發病機制復雜，尚未清楚。近年來，游離脂肪酸（FFA）被認為是IR的獨立危險因子。本實驗大鼠高脂高糖喂養12周，FBG、FINS模型組顯著增高，胰島素敏感性降低，出現明顯的IR，且血清、骨骼肌FFA較正常組明顯升高。

FFA在機體脂肪代謝中起樞紐作用。外源性的脂肪以FFA形式，經血漿運送至脂肪細胞，內源性的TG，在運動、饑餓時，迅速分解為FFA，進入各組織氧化利用。骨骼肌是機體能量代謝的重要器官，是胰島素作用的主要組織。餐后70%～90%的能量代謝發生在骨骼肌。研究顯示，脂肪酸攝入增加、氧化減少，是導致骨骼肌脂質沉積、IR的主要原因［9］。安靜或運動狀態下，機體主要有長鏈脂肪酸（LCFA）氧化供能，LCFA攝入需要脂肪酸轉位酶FAT/CD36轉運。FAT/CD36是細胞脂肪酸轉運的一種重要膜蛋白，特別是介導LCFA的跨膜轉運［10-11］。對嚙齒類動物和人的研究發現，在肥胖、IR及非酒精性脂肪肝等代謝性疾病中，FAT/CD36與脂肪酸的相互作用可能為其發病原理［12］。進入細胞內LCFA需要轉化為有活性的脂酰輔酶A（LccoAs），才能在線粒體進行a氧化。近期研究表明，活性脂代謝中間產物LccoAs與肌細胞對胰島素敏感性呈負相關，是誘導骨骼肌IR的主要原因［13］。肉堿脂酰轉移酶（CPT-1），是線粒體脂肪酸氧化的關鍵限速酶。CPT-1活性的少量增加至少在一定程度會導致肌細胞內脂質沉積減少［14］。另一項研究也發現，通過超表達CPT-1，可以改善脂肪酸誘導的IR，其機制可能與減少了脂代謝中間產物，激活了PKC，進而促進GLUT4攝取利用葡萄糖有關，這與最新的細胞研究相一致［15-19］。總之，以上途徑中任何一個酶活性改變均會引發脂質沉積，導致骨骼肌IR。本實驗模型組大鼠高脂高糖喂養12周，IR明顯，長鏈脂酰輔酶A（LccoAs）、FAT/CD36較正常組明顯增加，CPT-1含量明顯降低，同時伴有肌內TG增加。這說明長期高脂飲食，損傷脂肪酸的轉運及線粒體氧化功能，導致糖脂代謝紊亂，引起骨骼肌脂質沉積。燈盞花素，具有降脂、活血化瘀、抗炎及抑制血小板聚集等藥理作用。近期研究發現，燈盞花素還可增加糖尿病腎病大鼠AKT的表達，影響NF-kB的作用，抑制糖尿病大鼠腎臟肥大，從而保護腎臟［20-25］。實驗在IR模型基礎上，分別用燈盞花素200 mg/（kg·d）及100 mg/（kg·d）干預2周后，結果顯示燈盞花素明顯降低胰島素抵抗指數，FFA、TG，改善肌肉組織中的脂質沉積和IR，并且影響與脂代謝相關的LccoAs、FAT/CD36、CPT-1。

綜上所述，研究提示燈盞花素200 mg/（kg·d）和100 mg/（kg·d）具有改善肌骼肌脂代謝及IR作用，其機制可能與下調LccoAs、FAT/CD36表達，增加CPT-1的表達有關。

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The Effect of Breviscapine on Insulin Resistance in Skeletal Muscle Fatty Acid Metabolism in Rats

ZHANG Xin-yuan，WU Li，LI Jin-ping，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（14）：024-028

Objective：To discuss the effect of breviscapine on insulin resistance in skeletal muscle fatty acid metabolism in rats.Method：A total of 40 healthy male SD rats were selected，they were divided into the normal group of 10 and the high fat and sugar group of 30，normal feed，high fat and high sugar diets were given respectively，glucose tolerance test was performed after 12 weeks of feeding，30 rats were selected as model rats according to the standard，except for 4 poor state and the death of rats，the remaining 26 rats were divided into the model group of 9，breviscapine high dose group of 8 and breviscapine low dose group of 9.Breviscapine high，low dose group were respectively injected with a corresponding volume of breviscapine，the normal group and model group were intraperitoneally injected with volume of 0.9% sodium chloride solution，four groups were given drugs for 2 weeks，each index were detected by required organization after 2 weeks.Result：The model group abdominal fat index，fasting blood glucose （FBG），fasting serum insulin （FINS），insulin resistance index （IRI），serum and tissue FFA，TG，lipid droplets area/total area of muscle fiber，optical density mean value，LccoAs content and FAT/CD36 were the highest in four groups.Conclusion：Twelve weeks high fat and high sugar diet induce IR rats model，breviscapine can significantly improve insulin resistance and lipid deposition in skeletal muscle，it relate to CPT-1 expression upregulation and FAT/CD36 expression decreased.

Breviscapine； Insulin resistance； Long chain fatty acyl coenzyme A； Fatty acid translocation enzyme； Carnitine palmityl transferase

山西省科技攻關計劃項目（20051903）；山西醫科大學汾陽學院科研基金重點項目（1418）

①山西醫科大學 山西 太原 030000

②山西醫科大學汾陽學院

李錦平

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.14.006

2016-03-22） （本文編輯：李穎）