桑椹提取物與葉黃素聯合干預對視網膜光損傷小鼠抗氧化能力的影響

陳春艷，錢彩虹

(湖北生物科技職業學院，武漢　430070)

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桑椹提取物與葉黃素聯合干預對視網膜光損傷小鼠抗氧化能力的影響

陳春艷，錢彩虹

(湖北生物科技職業學院，武漢430070)

目的：評價桑椹提取物和葉黃素聯合干預對光損傷視網膜的抗氧化能力。方法：75只小鼠分為正常對照組、模型對照組和低、中、高劑量給藥組，采用自制光照箱進行造模，檢測視網膜組織的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)活力以及丙二醛(MDA)含量。結果：光照導致小鼠視網膜組織中SOD、GSH-Px、CAT和T-AOC活力顯著下降，MDA含量顯著增加，攝入低、中、高劑量受試物后，與模型對照組相比，SOD活力分別增加24.0%、50.4%和77.3%、GSH-Px活力分別增加13.9%、38.0%和56.5%、CAT活力分別增加26%、69.1%和93.5%、T-AOC活力分別增加15.4%、38.5%和46.2%、MDA含量分別降低20.0%、35.6%和47.2%，其中中、高劑量組具有顯著性差異(P<0.05)。結論：桑椹提取物和葉黃素聯合干預對視網膜光損傷小鼠具有抗氧化作用。

桑椹提取物；葉黃素；視網膜光損傷；抗氧化能力

視網膜容易受到強光的影響而造成視覺功能障礙、光誘導視網膜損傷等，從而造成細胞一系列損傷、凋亡、生物膜溶解和細胞壞死，導致感光細胞的凋亡和視網膜變性[1]。環境和人造光源都是視網膜損傷的潛在威脅[2，3]，因此研究篩選具有保護視網膜光損傷的活性成分具有非常重要的意義。氧化損傷是光導致視網膜損傷的機制之一，感光細胞外節盤膜中含有高水平的長鏈多不飽和脂肪酸，其對感光細胞具有保護作用，但易于氧化，慢性持續的光損傷會使眼內自由基的濃度增加，產生單線態氧、過氧化氫及羥基自由基等一系列自由基，作用于長鏈多不飽和脂肪酸產生脂質過氧化產物，破壞細胞膜的完整性、流動性，嚴重影響細胞功能[4-7]。桑椹是桑科桑屬植物成熟果穗的統稱，我國桑椹資源非常豐富，除青藏高原外，全國各地均有栽培。桑椹提取物中富含黃酮、糖類及生物堿等多種生物活性成分，其中桑椹多糖提取物具有顯著的清除自由基作用[8，9]；葉黃素可與細胞膜上的脂類結合，有效地抑制脂類的氧化反應，減輕氧化產物對視網膜的毒害[10，11]。葉黃素與桑椹提取物聯合干預對視網膜光損傷的保護作用還未見報道。本文以視網膜光損傷小鼠模型為研究對象，研究桑椹提取物和葉黃素聯合干預對氧化損傷的保護作用，為具有緩解視疲勞功能食品的研發提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

復方托吡卡胺滴眼液，沈陽興齊眼藥股份有限公司；氯霉素滴眼液，沈陽神龍藥業有限公司；SOD、MDA、CAT、GSH-PX和T-AOC檢測試劑盒，南京建成公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，碧云天公司；桑椹，市售；5%葉黃素，DSM公司。

1.2儀器與設備

SpectraMaxM2e酶標儀，美國Molecular公司；TES-1332A照度計，泰仕電子工業股份有限公司；DY89-Ⅱ型電動玻璃均漿機，寧波新芝生物科技有限公司；白色熒光燈(85W)，中山市重誠照明電器有限公司。

1.3實驗動物

健康成年昆明小鼠75只，購于湖北省疾病預防控制中心，雌雄不限，體重約25～32g，經前節及眼底檢查無眼部疾病。動物房內通風良好，自然晝夜光線照明。小鼠適應性喂養3d后開始實驗。

1.4實驗方法

1.4.1動物分組和造模給藥75只小鼠分為正常對照組、光損傷模型對照組和低、中、高劑量給藥組，每組5只，除正常對照組外，均進行光照處理。采用自制光損傷箱造模，箱的體積為1m3，箱內6個面均裝有36W的冷光源熒光燈共20個，箱頂裝有排風扇，光照箱四周及底部設有密集的通風小孔，用數字式光照度計檢測箱內的光照度為16 000～18 000lx。動物分組光照，每組5只。光照前先暗適應12h，于光照前30min，用復方托吡卡胺眼藥水對所有的動物進行雙眼散瞳，然后光照12h，再進行暗適應，連續3個循環，總光照時間為36h。在光照全過程中箱內溫度保持在28～32℃。光照前給藥2W、光照后給藥1W。低、中、高給藥劑量按照成人每日每kg體重攝入量(成人桑椹和葉黃素每天推薦在攝入量分別為3g、10mg)的5、10、20倍給藥，即小鼠桑椹給藥劑量分別為0.25、0.5、1g/kg；葉黃素給藥劑量分別為0.88、1.767、3.534mg/kg，桑椹10倍水95℃溫度下提取2次，每次40min，合并濃縮至合適濃度獲得桑椹多取物，加葉黃素微囊粉制成混懸液灌胃，低、中、高給藥組小鼠灌胃量分別為0.1、0.2、0.4mL/20g。

1.4.2視網膜組織中SOD、MDA、CAT、GSH-PX和T-AOC檢測各組小鼠取眼球，在冰盤上小心將眼球沿角鞏膜緣剪開，去除眼前節、晶體及玻璃體，剝除視網膜組織，用濾紙吸掉表面多余液體，置于EP管中，保存于-80℃超低溫冰箱中，待檢測生化指標(SOD、MDA、CAT、GSH-PX和T-AOC)使用。制備視網膜組織勻漿時，取出保存在-80℃液氮冰箱中的視網膜組織標本，分析天平準確稱量待測標本的重量，按重量體積比1∶9 加冰生理鹽水，在冰水浴下用研磨棒將EP管中視網膜組織研磨成組織勻漿。4℃、2 500r/min低溫高速離心機離心15min，取上清液備用。BCA蛋白濃度、SOD、MDA、CAT、GSH-PX和T-AOC根據試劑盒說明檢測。

1.5統計方法

2　結果與分析

2.1桑椹提取物和葉黃素聯合干預對視網膜組織中MDA含量的影響

視網膜在過量光照環境中視網膜發生脂質過氧化，會產生大量包括MDA的活性醛類物質，這些脂質過氧化產物能夠影響DNA功能，影響DNA的合成、裂解及轉錄，可損傷生物膜結構，使視網膜的脂類受到不可逆損傷[12，13]。圖1表明，光照能導致小鼠視網膜組織中MDA含量顯著增加，而攝入低、中、高受試物后，與模型組相比，MDA含量分別下降20.0%、35.6%和47.2%，其中，中、高劑量組具有顯著性差異(P<0.05)。

圖1　受試物對光損傷小鼠視網膜組織MDA含量的影響注：#表示與正常組相比具有顯著性差異(P<0.05)；*表示與模型組相比具有顯著性差異(P<0.05)，下同

2.2桑椹提取物和葉黃素聯合干預對視網膜組織中SOD活力的影響

外源性SOD作為一種抗氧化酶對視網膜的保護作用在以往大量實驗中已得到證實[14]。圖2結果表明，光照導致小鼠視網膜組織中SOD活力顯著下降(P<0.05)，光照射后視網膜組織中SOD活力降低而MDA含量升高，小鼠視網膜組織產生了自由基代謝紊亂現象[13]，而攝入低、中、高劑量受試物小鼠，與模型對照組相比，SOD活力分別增加24.0%、50.4%和77.3%，其中，中、高劑量組具有顯著性差異(P<0.05)。

圖2　受試物對光損傷小鼠視網膜組織SOD活力的影響

2.3桑椹提取物和葉黃素聯合干預對視網膜組織中CAT的影響

CAT也是體內重要的抗氧化酶系之一，SOD或者CAT活力下降，氧自由基可損傷關鍵性亞細胞結構[15]。圖3結果表明，光損傷小鼠模型視網膜組織中CAT活力與正常組對比下降57%(P<0.05)；攝入低、中、高劑量受試物后，與模型對照組相比CAT活力分別增加26%、69.1%和93.5%，其中中、高劑量受試物有顯著性差異(P<0.05)。

圖3　受試物對光損傷小鼠視網膜組織CAT活力的影響

2.4桑椹提取物和葉黃素聯合干預對視網膜組織中GSH-Px的影響

抗氧化物酶活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力[16]。圖4結果表明，光損傷模型小鼠視網膜組織中GSH-Px活力顯著下降(P<0.05)，低、中、高劑量模型小鼠中GSH-Px活力與模型對照組比較，分別增加13.9%、38.0%和56.5%，具有劑量效應關系，其中，中、高劑量受試物有顯著性差異(P<0.05)。

圖4　受試物對光損傷小鼠視網膜組織GSH-Px活力的影響

圖5　受試物對光損傷小鼠視網膜組織T-AOC活力的影響

2.5桑椹提取物和葉黃素聯合干預對視網膜組織中T-AOC的影響

在機體防御體系中，T-AOC能全面地反映動物機體的抗氧化狀態，其作用是維持內環境活性氧的動態平衡，清除過高的活性氧，使機體處于氧化還原相對穩定的狀態[17]。圖5結果表明，光照損傷小鼠模型視網膜組織中T-AOC活力與正常對照組相比顯著下降(P<0.05)，低、中、高劑量模型小鼠中GSH-Px活力與模型對照組比較，分別增加15.4%、38.5%和46.2%，具有劑量效應關系，其中，中、高劑量受試物有顯著性差異(P<0.05)。

3　結論

本文研究結果表明，強烈的光照射可導致小鼠視網膜抗氧化能力顯著下降，表現在視網膜組織抗氧化酶系活性降低、產生過量的丙二醛脂質過氧化產物，進而影響視網膜功能。采用不同劑量的桑椹提取物和葉黃素對光損傷小鼠模型聯合干預后，視網膜組織中SOD、GSH-Px和CAT等3個抗氧化體系保護酶活性顯著增加，從而顯著阻止了脂質過氧化產物的生產，MDA含量顯著下降，最終表現為能代表機體總體抗氧化狀態的T-AOC活性顯著增強，以上作用具有劑量效應關系，因此桑椹提取物和葉黃素聯合干預能有效抑制光損傷導致小鼠視網膜組織氧化應激過程。以上結果為緩解視疲勞保健食品研發提供了一定的科學依據。◇

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(責任編輯李婷婷)

Effects of Fructus mori Extracts and Lutein on Antioxidant Capability in Mice After Retinal Light Exposure

CHEN Chun-yan，QIAN Cai-hong

(Hubei Vocational College of Bio-technology，Wuhan 430070，China)

Fructus moriextracts；lutein；retinallightdamage；antioxidantcapability

FoodandNutritioninChina

陳春艷(1980—)，女，碩士，講師，研究方向：天然產物化學。