清肺口服液對RSV感染小鼠Treg/Th17及IL-2和IL-17水平的影響*

胡嬋嬋　袁　斌△　周立華　徐建亞　李江全　王明明　孔　飛（.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 009；.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 009）

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·研究報告·

清肺口服液對RSV感染小鼠Treg/Th17及IL-2和IL-17水平的影響*

胡嬋嬋1袁斌1△周立華2徐建亞2李江全2王明明2孔飛1
（1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210029）

目的 觀察清肺口服液對呼吸道合胞病毒（RSV）感染小鼠Treg/Th17細胞平衡的影響及對白介素-2 （IL-2）和白介素-17（IL-17）表達的影響。方法 將50只BABL/c小鼠按隨機數(shù)字法分為空白組、模型組、清肺低劑量組（1.33 g/mL）、清肺高劑量組（4 g/mL）、利巴韋林組，每組10只。用RSV（Long株）滴鼻48 h后，經(jīng)口灌胃分別給予相應藥物及等量0.9%氯化鈉注射液刺激，24 h后處死小鼠，立即取小鼠肺組織行病理分析，ELISA方法檢測肺泡灌洗液（BALF）中IL-2、IL-17的含量，流式細胞術方法檢測小鼠脾臟細胞中Treg、Th17細胞的表達含量。結果 與空白組相比，模型組的Treg/Th17及IL-2的水平下降（P<0.01），IL-17的水平升高（P<0.01）；與模型組相比，各給藥組的Treg/Th17升高（P<0.05），IL-2水平升高（P<0.01），IL-17的水平下降（P<0.01）；與利巴韋林組相比，清肺組IL-2水平升高（P<0.01），清肺高劑量組Treg/Th17升高（P<0.05），IL-17的水平下降（P<0.01），清肺低劑量組Treg/Th17下降（P<0.01），IL-17的水平升高（P<0.01）。結論 清肺口服液可以調節(jié)Treg/TH17細胞的平衡，并上調RSV感染小鼠IL-2的表達水平及下調IL-17的水平，從而發(fā)揮其抗RSV的作用。

清肺口服液RSVTreg/Th17IL-2IL-17

【Abstract】Objective：To investigate the effects of Qingfei oral liquid on the expression of Interleukin（IL）-2，Interleukin（IL）-17 and the balance of Treg/Th17 in mice's lung tissue infected with respiratory syncytial virus （RSV）.Methods：Fifty BABL/c mice were classified into five groups randomly：the control group，the model group，Qingfei oral liquid low dose group（1.33 g/mL）and high dose group（4 g/mL），Ribavirin group，ten mice in each group.Mice were molded with RSV（long strain）virus and given 48-hours'cultivation.24hours later，they were killed and the lung tissue was taken for pathological analysis immediately.ELISA was used to test the expression levels of IL-2 and IL-17 in BALF and flow cytometry test to the level of Treg and Th17 in the spleen. Results：Compared with the control group，the level of IL-2 and Treg/Th17 decreased and the level of IL-17 increased in the model group（P<0.01）；compared with the model group，both Qingfei oral liquid groups and Ribavirin group showed a significant increase in the expression of Treg/Th17（P<0.05）and IL-2（P<0.01），a decrease in expression of IL-17（P＜0.01）；compared with Ribavirin group，Qingfei oral liquid groups showed a significant increase in expressions of IL-2（P<0.01）.Qingfei Oral Liquid high dose group showed an increase in expression of Treg/Th17（P<0.05）and a decrease in expressions of IL-17（P<0.01）.Qingfei oral liquid low dose group showed a decrease in expression of Treg/Th17（P<0.05）and an increase in the expressions of IL-17（P< 0.01）.Conclusion：Qingfei oral liquid can regulate the balance of Treg/Th17，increase the expressions of IL-2 and decrease the expressions of IL-17 in the lung tissue of RSV infected mice，through which it can play a role of anti-RSV.

【Key words】Qingfei oral liquid；RSV；Treg/Th17；IL-2；IL-17

呼吸道合胞病毒（RSV）是肺炎患兒中檢出率最高的病毒［1］，也是引起嬰幼兒患病和死亡的重要原因［2］，大約有90%的兒童在2歲之內感染過RSV［3］。目前西醫(yī)治療尚缺乏特異性方案，中醫(yī)藥在提高免疫力、抗病毒、改善呼吸道癥狀等方面有獨特優(yōu)勢。中藥制劑清肺口服液是在經(jīng)方麻杏甘石湯的基礎上加減而成，具有開肺化痰、解毒活血之功效，臨床已證實其對RSV肺炎具有良好的效果［4-5］。本實驗通過建立RSV感染的小鼠模型，觀察清肺口服液對RSV感染的小鼠白介素-17（IL-17）、白介素-2（IL-2）及Treg/Th17表達的影響，探討清肺口服液治療RSV感染的作用機制，以期為RSV感染的臨床治療提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動物及分組取6～8周齡雌性BALB/c小鼠50只，體質量（20±2）g，購于北京維通利華實驗動物技術中心，合格證：SCXK（京）2012-0001。將50只小鼠按照隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、清肺低劑量組、清肺高劑量組、利巴韋林組，每組各10只。

1.2病毒株呼吸道合胞病毒A亞型 （Long株），由武漢國家典型培養(yǎng)物保藏中心提供，保存于南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院實驗研究中心。

1.3藥物與試劑清肺口服液：炙麻黃4 g，杏仁10 g，生石膏24 g，葶藶子6 g，桑白皮10 g，紫花前胡10 g，拳參12 g，制僵蠶6 g，丹參6 g，虎杖12 g。按照2010年版的《中華人民共和國藥典》中方法，制成質量濃度相當于生藥1.33 g/mL和4 g/mL兩種劑量的水煎劑（根據(jù)人與動物等效劑量折算公式得出）。新博林顆粒（利巴韋林顆粒），由四川百利藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)，規(guī)格：50 mg/袋。國藥準字：H51023508。批號：090532。配成質量濃度相當于生藥0.0025/mL。胎牛血清及培養(yǎng)基（維森特生物技術有限公司），ELISA試劑盒（上海聯(lián)碩生物科技有限公司），流式細胞術試劑盒：Mouse Treg/TH 17 Phenotyping Kit（出品：BD Pharmingen），Leukocyte Activation Cocktail，with BD Golgiplug（出品：BD Pharmingen），Stain Buffer（FBS）（出品：BD Pharmingen）。

1.4儀器低溫高速離心機Centrifuge 5810R；酶標儀EXL800型 （BioTek，USA）；流式細胞儀 （貝克曼CytomicsTMFC 500）；CO2培養(yǎng)箱（MCO-20，日本SANYO公司）；倒置顯微鏡（DMIL，德國Leica公司）等。

1.5模型制備在清潔級實驗動物房適應性飼養(yǎng)小鼠5 d后，分別將各組小鼠置于密封透明容器內以乙醚吸入性麻醉，空白組每只小鼠給予50 μL 0.9%氯化鈉注射液滴鼻刺激，其余各組給予RSV病毒按50 μL/只滴鼻。造模48 h后，分別予利巴韋林0.0025 g/mL（相當于小兒臨床等效量），清肺口服液1.33 g/mL（相當于小兒臨床等效量）和4 g/mL（相當于小兒臨床3倍等效量）灌胃給藥，空白組和模型組給予等劑量0.9%氯化鈉注射液刺激。

1.6標本采集與檢測給藥24 h后處死小鼠。1）肺病理組織評分。剖取肺小葉，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)取材，脫水，石蠟包理，制片，HE染色，由病理專業(yè)人員在光學顯微鏡下200倍閱片，評分標準［6］：肺泡壁充血、水腫、炎細胞浸潤各1分；肺氣腫1分；肺泡腔滲出1分；肺內支氣管上皮變性、腔內滲出各1分，累加所有分數(shù)，即為病理得分。2）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測小鼠肺泡灌洗液（BALF）中IL-2和IL-17的表達。摘眼球取血后處死小鼠，剝離出氣管，在環(huán)狀軟骨處剪一小口，插入8號灌胃器針頭并固定，連接1 mL注射器，先后用預冷的PBS 0.8 mL、0.6 mL、0.5 mL沖洗小鼠肺臟，灌洗液移至5 mL離心管中，整個過程于冰上進行，將離心管置于2500 r/min離心5 min，取上清液。根據(jù)ELISA試劑盒說明書，制作標準曲線，加樣，溫育，洗滌后用底物顯色，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD）值，計算樣品濃度。3）流式細胞術檢測小鼠脾臟細胞中Treg/Th17的水平。將剛摘取的小鼠脾臟加人冷的PBS研磨成為單細胞懸液，每管抽取200 μL左右；根據(jù)流式試劑盒操作流程進行染色、破膜及固定，最后上流式細胞儀檢測。

1.7統(tǒng)計學處理應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理。正態(tài)分布數(shù)據(jù)用（±s）表示，偏態(tài)分布用中位數(shù)（四分位間距）表示。資料正態(tài)分布且方差齊時，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著差異法；資料偏態(tài)分布時，采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　果

表1　各組小鼠肺組織病理改變評分比較（分，±s）

表1　各組小鼠肺組織病理改變評分比較（分，±s）

與模型組比較，*P＜0.05。

組別　n空白組　5模型組　5清肺高劑量組　5評分0.80±0.35*5.60±0.65 4.00±0.71*清肺低劑量組　5　4.80±0.57利巴韋林組　5　3.30±0.76*

2.1各組小鼠肺組織病理改變見表1。空白組小鼠肺組織未見異常變化；模型組小鼠肺組織出現(xiàn)肺泡壁中度充血、水腫，致肺泡壁增厚，肺內支氣管上皮變性；利巴韋林組小鼠肺內支氣管上皮細胞排列較整齊，腔內無明顯炎性滲出物；清肺低劑量組小鼠肺組織出現(xiàn)少量中性粒細胞和單核巨噬細胞浸潤；清肺高劑量小鼠肺組織未見明顯細胞壞死，管腔內未見滲出物，支氣管周圍無明顯水腫或炎細胞浸潤（見圖1）。與空白組比較，模型組肺組織病理評分增高 （P<0.01）；與模型組比較，利巴韋林組、清肺高劑量組肺組織病理評分降低（P<0.05）。

圖1　各組小鼠組織病理改圖片結果（HE染色，×200）

2.2各組小鼠BALF中IL-2、IL-17表達水平的比較如表2。空白組與模型組相比，兩者之間IL-2和IL-17的差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），各給藥組與模型組相比，清肺高、低劑量組，利巴韋林組作用于小鼠RSV肺炎可升高IL-2的水平（P<0.01），并降低IL-17的表達水平（P<0.01）。

表2　各組小鼠BALF中IL-2、IL-17表達水平比較（±s）

表2　各組小鼠BALF中IL-2、IL-17表達水平比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與利巴韋林組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組　別　n　IL-2（ng/L）　IL-17（pg/mL）空白組　5　60.11±1.07**　8.72±0.64**模型組　5　28.08±2.07　70.49±0.40清肺高劑量組　5　45.38±1.87**△△　30.96±1.02**△△清肺低劑量組　5　35.2±1.22**△△　55.89±0.72**△△利巴韋林組　5　33.43±0.49**　42.06±0.86**

2.3各組小鼠脾臟細胞中Treg/Th17水平的比較見表3。空白組與模型組相比，Treg/Th17的差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），各給藥組與模型組相比，清肺口服液高、低劑量組作用于RSV肺炎小鼠后可上調Treg 及Treg/Th17的水平，下調Th17。

表3　各組小鼠脾臟細胞中Treg、Th17表達水平及Treg/Th17比值比較（±s）

表3　各組小鼠脾臟細胞中Treg、Th17表達水平及Treg/Th17比值比較（±s）

組　別　n　Treg空白組　4　4.70±0.39**模型組　4　2.41±0.49清肺高劑量組　4　4.70±0.84**△△清肺低劑量組　4　3.43±0.30*利巴韋林組　4　4.86±0.80**Th17　Treg/Th17 1.37±0.29**　3.52（1.61）**5.26±1.15　0.42（0.20）0.87±0.05**△△5.09（2.36）**△1.76±0.18*△△1.98（0.25）*△△1.23±0.07**　4.03（1.42）**

3　討　論

RSV感染引起的RSV肺炎是引起嬰幼兒下呼吸道感染最常見的原因［7］。患病時年齡越小，RSV病毒載量越高，其病情越重，住院時間及臨床癥狀持續(xù)的時間越長［8-9］。嬰兒時期有嚴重RSV肺炎病史的兒童，以后發(fā)展成為哮喘等過敏性疾病的幾率增加［10］，并可能影響其免疫系統(tǒng)的發(fā)育［11］。西醫(yī)尚無有效的防治方法，中醫(yī)藥清熱解毒、活血化瘀、化痰止咳等方法，在抗病毒、縮短病程、改善癥狀等方面具有一定的優(yōu)勢［12-13］。清肺口服液具有開肺化痰，解毒活血之功效，在治療RSV肺炎痰熱閉肺證中取得了良好的效果［5］，但中藥復方抗RSV的機理尚未完全揭示，其與免疫學、分子細胞生物學方面的結合有待進一步研究。

RSV感染可以上調Th17細胞，下調Treg細胞［14］。Th17在炎癥反應中發(fā)揮著重要的作用，其分泌的IL-17具有促炎作用［15］。而Treg在防止RSV病毒引起的免疫損傷方面具有重要的作用，其可以抑制炎癥反應［16］。研究表明，Treg細胞可以通過下調抗病毒的T細胞的反應性來減輕由于病毒高復制引起的免疫損傷［17］。IL-2是調控免疫應答的重要因子，可以抑制CD4+T淋巴細胞向Th17細胞的分化，促進Treg細胞的增加［18］，并與某些自身免疫疾病的產(chǎn)生有關［19］。IL-2連續(xù)10 d用于正常的小鼠，可以使血中的Treg增加至2倍［20］，結核桿菌感染的早期應用IL-2治療，可以同時使血液和肺間隔的Treg細胞增多，減輕肺結核患者肺部的炎癥和損傷［21］。IL-2具有抑制Th17細胞和IL-17產(chǎn)生的作用，研究顯示，敲除IL-2基因可使小鼠血清中IL-17及Th17細胞的水平升高［22］。IL-17可通過直接抑制T-bet、IFN-γ等的活性發(fā)揮促炎作用，嚴重的RSV感染的嬰幼兒其呼吸道分泌物中IL-17的水平升高，敲除IL-17基因或給予抗IL-17治療可使RSV感染小鼠的呼吸道黏液分泌明顯減少，炎癥減輕，病毒載量下降，同時IL-17還參與了RSV相關的過敏性的呼吸道疾病［23］。轉化生長因子-β（TGF-β）由Treg細胞分泌，是調節(jié)組織炎癥和修復的重要細胞因子，其與促炎因子結合可以影響Th17和Treg的水平。TGF-β在低濃度時與IL-6和IL-21協(xié)同促進IL-23R的表達，從而上調Th17，高濃度時則抑制IL-23R的表達，從而上調Treg。Foxp3和RORγt分別為Treg和Th17的轉錄因子，在體內TGF-β可以促使Foxp3抑制RORγt的功能從而下調 Th17；IL-6，IL-21和 IL-23可以降低Foxp3對RORγt的抑制，上調Th17細胞，因此，Th17 和Treg細胞的平衡依賴于多種細胞因子的調節(jié)，失去Treg的作用，Th17細胞會失去抑制而異常升高［24］，從而發(fā)生嚴重的炎癥反應。

本次實驗研究結果顯示，模型組小鼠肺泡壁明顯增厚，中度充血及肺間質炎癥細胞浸潤，給藥組小鼠肺組織病變程度較模型組減輕，肺部無明顯充血及炎性滲出物。與模型組相比，清肺口服液及利巴韋林顆粒作用于RSV肺炎小鼠后可使BALF中IL-2的水平升高，IL-17的水平降低，同時可以上調Treg，下調Th17，使Treg/Th17的水平升高，表明清肺口服液可以通過上調Treg/Th17及IL-2的水平，降低IL-17的水平而發(fā)揮抗病毒、開肺化痰、解毒活血之功效。與利巴韋林組相比，清肺高劑量組的Treg/Th17及IL-2的水平升高，IL-17的水平降低，清肺低劑量組的Treg/Th17的水平下降，IL-2及IL-17的水平升高，表明清肺口服液高劑量組的作用優(yōu)于利巴韋林組，但清肺口服液低劑量組在升高Treg/Th17及降低IL-17水平方面劣于利巴韋林組，由此可知清肺口服液治療RSV肺炎具有劑量依賴性，劑量越高，效果越好，適當增加劑量，其治療RSV肺炎的作用可優(yōu)于利巴韋林。中醫(yī)中藥在治療RSV肺炎中具有較好的應用前景，本實驗不僅證實了清肺口服液治療RSV肺炎的有效性，也為探討其發(fā)病機制提供了思路。

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（收入日期2016-02-25）

The Effects of Qingfei Oral Liquid on Expression of Treg/Th17，IL-2 and IL-17 in RSV Infected Mice

HU Chanchan，YUAN Bin，ZHOU Lihua，et al.The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu，Nanjing 210029，China.

R285.5文獻標志碼：A

1004-745X（2016）06-0941-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.001

國家自然科學基金資助項目（81574025）；江蘇省兒童呼吸疾病（中醫(yī)藥）重點實驗室開放課題（JKLPRD201410）

△（電子郵箱：yuanbin68358@163.com）