高效脫氮菌株的篩選、鑒定及氨氮降解特性的研究

丁少華，孫葉鳳，阮佳驊，史吉平，孫俊松

(1上海華強環(huán)保設備工程有限公司，上?！?01210;2 上海科技大學生命科學與技術(shù)學院，上?！?01210;3 中國科學院上海高等研究院生物煉制實驗室，上?！?01210)

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高效脫氮菌株的篩選、鑒定及氨氮降解特性的研究

丁少華1，孫葉鳳1，阮佳驊1，史吉平2,3，孫俊松2,3

(1上海華強環(huán)保設備工程有限公司，上海201210;2 上?？萍即髮W生命科學與技術(shù)學院，上海201210;3 中國科學院上海高等研究院生物煉制實驗室，上海201210)

降低氨氮是水污染治理或污水處理的重要指標之一，微生物脫氮是非常環(huán)保有效的方法。本文從活性污泥中分離篩選出多株具有很強脫氮能力的微生物，其中活性最強的一株菌A2初步鑒定屬于Comamonas屬，屬于一株腸桿菌。對菌株A2進行了生長和生物脫氮能力的系統(tǒng)研究，考察了不同氨氮濃度對生物脫氮效果的影響，結(jié)果表明：A2具有高效去除氨氮的能力，當培養(yǎng)基中氨氮濃度為100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L時，脫氮率分別為97%，88%，82%，79%。

污水治理；生物脫氮；菌種鑒定

工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及生活排污帶來的氨氮過量排放，造成我國包括主要的湖泊河流在內(nèi)的各類自然水體的富營養(yǎng)化現(xiàn)象十分嚴重，直接導致水體的自凈功能下降，BOD、COD等數(shù)據(jù)超標，帶來嚴重的生態(tài)環(huán)境污染問題。自然水體中氨氮的去除主要依靠自養(yǎng)的氨氧化菌及硝化菌先將氨氧化，并由反硝化微生物進行硝酸及亞硝酸基團的還原脫氮過程，最終生成N2、NO或N2O等無機氮氣體排放，從而實現(xiàn)生物圈的氮循環(huán)。然而目前我國許多自然水體中的氨氮的排放遠超出自然環(huán)境所能承受的范圍[1]，因此，研究和開發(fā)經(jīng)濟有效的生物脫氮工藝和方法，已成為亟待開展的重要研究課題，也是幾十年來全世界的研究熱點之一。雖然國內(nèi)外對氨氧化工藝研究的比較多[2-3]，但對優(yōu)良微生物的分離鑒定及以提高氨氮降解效率為目的的生理特性研究較少，本實驗利用污水處理廠的活性污泥，進行高效微生物的分離篩選，獲得多株氨氮高降解的菌株，并對其中一株進行了系統(tǒng)的除氨氮培養(yǎng)研究，分析了氨氮濃度等因素對其氨氮降解率的影響，該研究可以為水處理中的生物脫氮工藝提供微生物資源，并為中試應用提供實驗依據(jù)。

1　實　驗

1.1材料與培養(yǎng)基

篩選樣品于2014年9月12采自常州某高濃度氨氮廢水處理項目。

富集培養(yǎng)基[4]：(NH4)2SO42.0 g，NaCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，NaHCO31.6 g，加蒸餾水到1000 mL，pH值7.2。分離培養(yǎng)基：(NH4)2SO42 g，NaCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，琥珀酸鈉·6H2O 24 g，pH值 7.0。固體培養(yǎng)基：補加2.0%瓊脂，其他成分同分離培養(yǎng)基相同。

1.2儀器與試劑

超凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；移液槍，Eppendorf；臺式搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；紫外-可見分光光度計，Benkman Coulter；FD-1A-50冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；離子濺射儀，瑞士BA L-TEC公司；掃描電鏡，荷蘭FEI公司。

1.3　實驗方法

1.3.1菌種的富集培養(yǎng)和分離純化

1.3.2菌種的馴化及鑒定、電鏡分析

將純化得到的各菌種接種至分離培養(yǎng)基平板上，置30℃溫箱培養(yǎng)2天，挑取長出的菌株接種到液體分離培養(yǎng)基中，并逐步增加分離培養(yǎng)基中(NH4)2SO4的量，使培養(yǎng)基中的氨氮濃度達到200 mg/L、400 mg/L，對初篩菌進行不斷馴化，最終得到試驗菌株。再根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》中有關(guān)細菌形態(tài)和生理生化等特性對分離出的菌株進行鑒定[6]。挑取單菌落采用細菌通用引物8f/1492r擴增菌株的16S rDNA片段，PCR反應體系和反應條件參照文獻。獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送生物公司(上海生工生物工程有限公司)測序，測序結(jié)果使用生物信息工具(NCBI網(wǎng)站上的BLASTn)比對，獲得的同源序列再利用EZeditor和MEGA6軟件進行遺傳樹分析。

掃描電鏡的微生物樣本前期處理如下：將過夜培養(yǎng)的菌株培養(yǎng)液先自然干燥，然后通過乙醇梯度脫水(分別為 30%、50%、70%、85%、90%乙醇各 1 次，100%乙醇 2 次，15 min/次)，再將樣本經(jīng)冷凍干燥機冷凍48 h后，經(jīng)SCD005 離子濺射儀噴金100 s,再利用QUANTA 200 掃描電鏡對電鏡樣本進行觀察和記錄。

將初篩菌種子液分別接種于內(nèi)裝100 mL分離培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，搖床培養(yǎng)，每隔2 h取樣，檢測菌體生長，(以600 nm處的濁度OD600表示)，實驗設置三個平行。同時測定在氨氮濃度在200 mg/L時的降解情況，能力最強的菌株記為試驗菌。

2　結(jié)果與討論

2.1脫氮微生物的富集與分離

圖1　三株菌的生長曲線

圖2　株菌的氨氮降解能力

污水廠的活性淤泥經(jīng)經(jīng)只含氨氮的培養(yǎng)基富集后，利用固體培養(yǎng)基分離到了3株微生物純種單克隆，分別將這幾株菌接種到分離培養(yǎng)基中，由圖1、圖2可以看出，這幾株菌在營養(yǎng)貧瘠的分離培養(yǎng)基中均呈現(xiàn)良好的生長狀態(tài)，從圖1可以看出，隨著培養(yǎng)時間的推移，每株菌達到穩(wěn)定期的時間不同，其中菌株E對分離培養(yǎng)的適應性最佳；而從圖2可以看出，當培養(yǎng)基中氨氮濃度為200 mg/L時，A2的氨氮降解率較D和E要高，因此后續(xù)對A2進行了系統(tǒng)地生物脫氮培養(yǎng)和菌株鑒定實驗。

2.2實驗菌株A2的電鏡觀察及分子鑒定

分離提純后的A2菌在電鏡觀察中呈現(xiàn)梭狀，長3～4 μm，寬約1～2 μm(圖3)。同時，16S rDNA的測序結(jié)果經(jīng)同源比對后輸入生物分析軟件Ezeditor(ver 1.0.23)，并導入MEGA6軟件構(gòu)建遺傳樹，結(jié)果如圖4所示，證實這株菌的16S rDNA序列與Comamonas testosteroni(從毛單胞菌)的種屬相似性最高，從而確定A2為叢毛單胞菌屬。

圖3　A2菌株的電鏡圖

圖4　A2菌株的遺傳樹分析結(jié)果

2.3氨氮濃度對A2菌株的生物脫氮效果的影響

圖5　不同氨氮濃度中叢毛單胞菌A2 降解能力的影響

3　結(jié)　論

研究表明，從污水處理廠淤泥中獲取得到的幾株微生物均有較好的生物脫氮能力，其中表現(xiàn)最好的一株微生物經(jīng)分子生物學鑒定為叢毛單胞菌A2，其在在氨氮濃度范圍100～400 mg/L時均具有很強的降解氨氮的能力，100 mg/L氨氮的營養(yǎng)液中，其氨氮降解率接近100%，而大部分河道池塘湖泊中的有機氮含量均低于100 mg/L，因此，叢毛單胞菌A2在這些污水環(huán)境中的生物治理中有著廣闊的應用前景。

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[2]張志軍,徐智煒,楊麗芳.微污染水源水處理技術(shù)脫氮除磷效果的研究[J].水處理技術(shù),2009,35(1):11-14.

[3]劉亞敏,郝卓莉.高氨氮廢水處理技術(shù)及研究現(xiàn)狀[J].水處理技術(shù),2012(S1):7-11.

[4]張玲華,鄺哲師,張寶玲.高效硝化細菌的富集培養(yǎng)與分離[J].浙江農(nóng)業(yè)學報,2002,14(6):348-350.

[5]李君文,鄭金來,晁福寰,等.一些硝化細菌的分離與鑒定[J].應用與環(huán)境生物學報,2004,10(6):786-789.

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[8]水和廢水監(jiān)測分析方法編委會.水和廢水監(jiān)測分析方法.3版[M].北京:中國環(huán)境科學出版社,1997:272-274.

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[10]蔣彬,呂錫武.生物脫氮除磷機理及技術(shù)進展[J].安全與環(huán)境工程,2005,12(3):74-77.

Effective Denitrifier Strains Screening,Identification and Research of Ammonia Nitrogen Degradation Characteristics

DING Shao-hua1,SUN Ye-feng1,RUAN Jia-hua1,SHI Ji-ping2,3,SUN Jun-song2,3

(1 Shanghai Huaqiang Environmental Protection Equipment & Engineering Co.,Ltd.,Shanghai 201210;2 School of Life Science and Technology,Shanghai Technology University,Shanghai 201210;3 Shanghai Advanced Research Institute,Chinese Academy of Sciences BiologicalRefining laboratory,Shanghai 201210,China)

Ammonia nitrogen concentration is one of important index in water quality control,biodegradation of ammonium nitrogen removal is a favorable way in water pollution treatment,which is a biological process involved various group of microorganisms.In this study,three strains with high capability in ammonia nitrogen degrading were isolated from activated sludge.Among of them,strain A2 demonstrated the highest activity in ammonia removal during growth in synthetic medium.A2 was preliminarily identified to belong to genus Comamonas,family of Comamonadaceae.The study also showed that removal of ammonia nitrogen was as high as 97%,88%,82%,79%when A2 was cultivated in medium containing ammonia at concentration of 100 mg/L,200 mg/L,300 mg/L or 400 mg/L,respectively.

water treatment; ammonia biodegradation; strain identification

X703,X52

A

1001-9677(2016)06-0075-03