體外大量擴增原發性肝癌腫瘤浸潤淋巴細胞及其生物學特性的初步分析

秦鵬，柴曉菲，王昭月，買玲，高全立

·論著·

體外大量擴增原發性肝癌腫瘤浸潤淋巴細胞及其生物學特性的初步分析

秦鵬，柴曉菲，王昭月，買玲，高全立

目的探討體外大量培養擴增原發性肝癌腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）的新方法，并初步研究其分子表型和功能特征。方法20 例手術切除的原發性肝癌組織經混合消化酶消化為單個細胞后，應用密度梯度離心法分離其中的淋巴細胞，然后應用兩步培養法大量擴增 TILs，并檢測它們的生長擴增速度。應用流式細胞儀檢測擴增淋巴細胞的分子表型，ELISA 法檢測其 IFN-γ 的分泌水平，并分析高表達 PD-1和低表達 PD-1 分子 TILs 分泌 IFN-γ 的能力。

結果18 例標本中的 TILs 在體外經兩步法培養后可以擴增達到 1010數量級。擴增的 TILs 中 CD3+細胞的比例為（91.7 ± 7.4）%，CD3+CD56+細胞的比例為（28.5 ± 11.7）%，CD3+CD4+細胞的比例為（32.5 ± 19.6）%，CD3+CD8+細胞的比例為（62.5 ± 29.1）%。PD-1 分子在 CD3+CD8+細胞的比例為（23.5 ± 16.1）%。擴增的 TILs 分泌 INF-γ 的水平為（827.8 ± 307.7）pg/ml，其中 9 例 PD-1 分子低表達的 CD3+CD8+細胞的分泌 INF-γ 的水平為（1087.5 ± 249.6）pg/ml，6 例 PD-1 分子高表達的 CD3+CD8+細胞的分泌 INF-γ 的水平為（478.6 ± 69.3）pg/ml，兩者相比有明顯差異（P ＜ 0.05）。

結論應用兩步培養法從原發性肝癌中大量擴增 TILs 簡便易行，擴增的 TILs 主要為 CD3+CD8+T 淋巴細胞，且TILs 中 PD-1 的表達與其分泌 IFN-γ 的能力呈負相關。

腫瘤浸潤淋巴細胞；干擾素 γ；程序性細胞死亡受體 1；原發性肝癌

www.cmbp.net.cn中國醫藥生物技術， 2016， 11（4）：324-328

原發性肝癌是在亞洲發病率很高的惡性腫瘤，我國肝癌發病率和死亡率是世界上最高的，占全球每年新發病例和死亡人數的 55%［1］。由于原發性肝癌起病隱匿，確診時多已屬中晚期，且患者對放療和化療均不敏感，因此治療效果較差［2］。臨床中發現個別肝癌患者單獨應用免疫治療后巨大腫塊消失并能獲得長期存活［3］，提示部分肝癌對免疫治療敏感。腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）具有較強的特異性殺傷腫瘤細胞的能力，Klapper 等［4］首先在培養體系中應用大劑量 IL-2 將惡性黑色素瘤組織的TILs 擴增到一定數量，然后經 CD3 單抗和同種異體外周血單個核細胞刺激，將惡性黑色素瘤的TILs 擴增到 1010數量級，用于治療進展期惡性黑色素瘤取得了超過 70% 的有效率。肝腫瘤微環境內往往浸潤有大量的淋巴細胞，如能將它們擴增后回輸，可能對肝癌有較好的治療作用。本課題探討應用兩步法體外大量擴增肝癌 TILs，初步分析其分子表型和功能，為應用 TILs 治療肝癌提供實驗和技術基礎。

1　材料和方法

1.1材料

20 例肝癌樣本均為河南省腫瘤醫院肝膽外科2009 年 11 月 - 2010 年 9 月手術切除所得，均經病理證實為肝細胞性肝癌。患者中男 13 例，女7 例，年齡 34 ～ 62 歲，平均年齡 46 歲。均在腫瘤中心取材，大小約為 2 cm × 2 cm × 2 cm；RPMI 1640 培養基為美國 Gibcobrl 公司產品；混合膠原酶（I，II，IV）、透明質酸酶、脫氧核糖核酸酶均購自美國 Sigma 公司；人 AB 血漿購自河南省中心血站；健康供者外周血單個核細胞由河南省中心血站惠贈；重組人白介素-2 購自北京四環生物制藥有限公司；淋巴細胞分離液為中科院生物工程研究所產品；CD3、CD4、CD8、CD56、PD-1 以及 IgG1同型對照和 ELISA 檢測 IFN-γ 試劑盒均購自美國 BD 公司。

1.2方法

1.2.1TILs 細胞的分離將手術切除的腫瘤組織立即在無菌條件下去除腫瘤表面壞死組織和結締組織，用 RPMI 1640 漂洗并剪成約 0.5 mm × 0.5 mm × 1 mm 的小塊，種瓶并用混合膠原酶（I，II，IV）、透明質酸酶和 DNA 酶 I 混合消化，37 ℃消化 3 ～ 4 h 后腫瘤組織被消化為單個核細胞，過濾并離心清洗。重新混懸離心后的沉淀并將等體積的 100% 和 75% 的淋巴細胞分離液先后置于離心管中，然后將細胞懸液慢慢加至最上層，非連續密度梯度離心 20 min（2000 r/min），收取下層界面的淋巴細胞。

1.2.2TILs 細胞的培養和擴增應用兩步法擴增分離的 TILs。首先將分離出的 TILs 細胞懸浮于含有大劑量 IL-2（6000 U/ml）和 10% 人 AB 血清的 RPMI 1640 的培養基內，置于 37 ℃、5% CO2的培養箱內培養。每 3 ～ 5 天換液 1 次。當細胞總數生長至約 1 × 107個時，將其轉入含有 30 ng/ml OKT3 和 2 × 108個同種異體的經輻射滅活的健康供者外周血單個核細胞（PBMC）的培養瓶內。健康供者 PBMC 輻照劑量為 50 Gy。第 2 天加入IL-2 并調整其在培養液中的濃度為 6000 U/ml。以后每 3 天計數 1 次細胞并定期傳代。

1.2.3流式細胞儀檢測 TILs 的分子表型流式染色 CD3、CD4、CD8、CD56 和 PD- 1，檢測其在每個培養出的腫瘤浸潤 T 淋巴細胞的表達。

1.2.4ELISA 檢測按每孔 3 × 106個細胞的密度將培養出的淋巴細胞種入 96 孔板，24 h 后收上清，ELISA 試劑盒檢測 IFN-γ 分泌量。

1.3統計學處理

兩組比較用 t 檢驗，所有統計學處理均用SPSS17.0 軟件完成。

2　結果

2.1體外 TILs 的大量擴增

應用含有大劑量 IL-2（6000 U/ml）和 10% 人AB 血清的 RPMI 1640 的培養基培養后，20 例肝癌標本中只有 1 例的 TILs 不能增殖，其余 19 例樣本的 TILs 均能在體外快速擴增，但有 1 例擴增到 6.7 × 106個細胞時停止增長，其余的 18 例TILs 均能生長到 1 × 107數量級。當應用 CD3 單抗和滅活的健康供者的 PBMC 刺激培養后，18 例樣本的 TILs 均能快速增殖到 1 × 109數量級，且持續增殖并最終達到 1010。每個樣本均在擴增第10 天計數，結果見圖 1。

2.2大劑量擴增后 TILs 的分子表型分析

18 例經兩步法擴增的 TILs，經流式細胞分析后擴增的 TILs 中 CD3+細胞的比例為 91.7% ± 7.4%，CD3+CD56+細胞的比例為 28.5% ± 11.7%，CD3+CD4+細胞的比例為 32.5% ± 19.6%，CD3+CD8+細胞的比例為 62.5% ± 29.1%，圖 2 為樣本 5、11、17 TILs 擴增后流式細胞分析結果。

圖1　18 例能快速擴增的 TILs 經過 CD3 和健康供者 PBMC 刺激10 d 時的細胞計數（N2 和 N14 擴增失敗）Figure 1　The cell accounts of eighteen TILs which can be expanded rapidly after stimulated for 10 d by CD3 and healthy honers' PBMC （N2 and N14 were failed to be expanded）

圖2　流式細胞儀檢測擴增 TILs 的表型（CD3、CD4、CD8、CD56 在 TILs 中的表達）Figure 2　The phenotype of expanded TILs by flow cytometry （The expression of CD3， CD4， CD8， CD56 on TILs）

2.3PD-1 在 CD3+CD8+TILs 的表達及 IFN-γ 的分泌

PD-1 分子在 CD3+CD8+細胞的比例為23.5% ± 16.1%（圖 3）。擴增的 TILs 分泌 INF-γ的水平為（827.8 ± 307.7）pg/ml。

流式細胞儀檢測 CD3+CD8+細胞表面可以檢測到不同程度的 PD-1 的表達，為比較 PD-1 的表達程度對 TILs 細胞分泌 IFN-γ 的影響，本實驗按其表達程度將這些細胞分為 PD-1 低表達組和高表達組，9 例表面表達 PD-1低于 10% 的歸為低表達組，6 例表面表達 PD-1 高于 20% 的劃為高表達組，另外 3 例表達在 10% ～ 20% 之間的未入組。結果見表 1，低表達 PD-1 分子的 CD3+CD8+細胞分泌 INF-γ 的水平為（1087.5 ± 249.6）pg/ml，高表達 PD-1 分子的 CD3+CD8+細胞分泌 INF-γ的水平為（478.6 ± 69.3）pg/ml，高表達 PD-1 組TILs 細胞 IFN-γ 分泌量明顯少于低表達 PD-1組，兩者相比有顯著性差異（P ＜ 0.05）。

圖3　流式細胞儀檢測 N5 和 N7 CD3+CD8+TILs 表面PD-1 的表達Figure 3　The expression of PD-1 on N5 and N7's CD3+CD8+TILs tested by flow cytometry

表1　低表達 PD-1 組和高表達 PD-1 組CD3+CD8+細胞 IFN-γ 分泌量Table 1　The IFN-γ secretion of CD3+CD8+TILs in low PD-1 expressed group and high PD-1 expressed group

3　討論

原發性肝癌為我國常見的惡性腫瘤之一，由于多數肝癌患者發現時已無手術機會以及肝癌細胞對化療和放療的不敏感，其治療一直是一個亟待解決的難題。

腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）回輸是近年發展起來的一種抗腫瘤免疫治療方法，如何分離培養腫瘤微環境內的 TILs 細胞并使其擴增到可以達到治療效果的數量級一直存在一些技術和應用上的難題，且此方面的國內報道較少。

在本課題的研究過程中，通過嘗試不同的培養方法，最終成功地應用兩步法培養擴增切除的肝癌組織內的 TILs 細胞，使其達到 1010個數量級。兩步法包括樣本取回后淋巴細胞的分離和培養，以及培養一定程度后應用 CD3 和同種異體單個核細胞刺激 TILs 快速增殖。成熟的培養方法的建立給以后的試驗性臨床應用提供了良好的基礎。

初步分析肝癌內 TILs 的分子表型發現，大部分 TILs 中以 CD8+細胞為主，而有研究發現，肝癌組織內浸潤 CD8+細胞的數量與患者的預后呈正相關。也有人發現富集 CD8+細胞可以提高TILs 細胞殺傷惡性黑色素瘤細胞的功能［5］，而肝癌TILs 中 CD8+細胞數量與其功能的影響仍有待進一步的研究。

實驗結果還發現，在 CD3+CD8+細胞上可以檢測到 PD-1 的表達，而且高表達 PD-1 組和低表達 PD-1 組其分泌 IFN-γ 的能力有明顯不同，也就表示，TILs 表面 PD-1 的表達可以影響 TILs的功能。曾有人研究過惡性黑色素瘤內浸潤 T 淋巴細胞表面 PD-1 的表達和功能的影響，結果證明腫瘤內浸潤的腫瘤抗原特異性的 CD8 細胞高表達PD-1 且功能受損［6］。而本次實驗則發現在肝癌TILs 內高表達 PD-1 的 CD3+CD8+細胞其功能也受到影響，分泌 IFN-γ 的能力減弱。

PD 是 I 型跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族CD28/CTLA-4 亞家族成員。人 PD-1 基因位于2q37，在正常狀態下 T、B 細胞不表達，但在活化狀態下誘導高表達。PD-1 和 TCR（T 細胞受體）結合可導致 SHP-2 的迅速磷酸化而抑制 TCR 信號，進而傳遞負性信號，在外周免疫耐受的建立中有重要作用［7］。而 PD-1 如何通過通路傳遞信號影響肝癌 TILs 中 CD8+細胞的功能為下一步研究的重點。

［1］ Bosch FX， Ribes J， Cléries R， et al. Epidemiology of hepatocellular carcinoma. Clin Liver Dis， 2005， 9（2）：191-211.

［2］ El-Serag HB. Hepatocellular carcinoma. N Engl J Med， 2011， 365（12）：1118-1127.

［3］ Giglia JL， Antonia SJ， Berk LB， et al. Systemic therapy for advanced hepatocellular carcinoma： past， present， and future. Cancer Control，2010， 17（2）：120-129.

［4］ Klapper JA， Thomasian AA， Smith DM， et al. Single-pass，closed-system rapid expansion of lymphocyte cultures for adoptive cell therapy. J Immunol Methods， 2009， 345（1-2）：90-99.

［5］ Prieto PA， Durflinger KH， Wunderlich JR， et al. Enrichment of CD8+ cells from melanoma tumor-infiltrating lymphocyte cultures reveals tumor reactivity for use in adoptive cell therapy. J Immunother， 2010，33（5）：547-556.

［6］ Ahmadzadeh M， Johnson LA， Heemskerk B， et al. Tumor antigen-specific CD8 T cells infiltrating the tumor express high levels of PD-1 and are functionally impaired. Blood， 2009， 114（8）：1537-1544.

［7］ Schmidt N， Flecken T， Thimme R. Tumor-associated antigen specific CD8+ T cells in hepatocellular carcinoma - a promising target for immunotherapy. Oncoimmunology， 2014， 3（9）：e954919.

【Abstract】

ObjectiveTo explore a new method that can generate large scale tumor infiltrating lymphocytes （TILs） suitable for clinical use，and to analyze their molecular phenotype and biological function.

MethodsSingle cells were obtained by digesting freshly resected tumors of twenty hepatoma patients with mixed collagenase， and lymphocytes were then separated by the discontinuous density gradient centrifugation. TILs were expanded by two-step culturemethod. Molecular phenotype of generated TILs was tested by flow cytometry and the quantitation of IFN-γ secretion was detected by ELISA essay. The ability to secret IFN-γ from PD-1 high expressed TILs and PD-1 low expressed TILs was analysed afterwards.

ResultsThere were eighteen TILs samples reaching the 1010order of magnitude through two-step culture method. The proportion of CD3+TILs， CD3+CD56+TILs， CD3+CD4+TILs and CD3+CD8+TILs was （91.7 ± 7.4）%， （28.5 ± 11.7）%， （32.5 ± 19.6）% and （62.5 ± 29.1）%， respectively. The proportion of PD-1 expression in CD3+CD8+TILs was （23.5 ± 16.1）%. The quantitation of IFN-γ secretion in the expanded TILs was （827.8 ± 307.7） pg/ml， among which this IFN-γ values in six higher expressed PD-1 cases and nine lower expressed PD-1 cases of CD3+CD8+TILs were （478.6 ± 69.3） pg/ml and （1087.5 ± 249.6） pg/ml， respectively. The differences between these two groups had statistically significance （P ＜ 0.05）.

ConclusionIt is easy to expand TILs from primary hepatocarcinoma to a large scale number for clinical use by using the two-step culture method and the major population of the expanded TILs is CD3+CD8+T cells. In addition， the expresson of PD-1 in TILs are negatively correlated with its secretion of IFN-γ.

Author Affiliation： Cancer Biotherapy Department， The Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450008，China

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol， 2016， 11（4）：324-328

Large scale amplication of the tumor infiltrating lymphocytes from primary hepatocarcinoma ex vivo and analysis of their biological characteristics

QIN Peng， CHAI Xiao-fei， WANG Zhao-yue， MAI Ling， GAO Quan-li

Lymphocytes， tumor-infiltrating；Interferon-gamma；Programmed cell death 1 receptor；Primary hepatocarcinoma

GAO Quan-li， Email： quanligao1@aliyun.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.04.007

國家自然科學基金青年基金（81502468）

450008 鄭州大學附屬河南省腫瘤醫院生物治療中心

高全立，Email：quanligao1@aliyun.com

2016-02-22