PirAB毒力正在向親緣關系較遠的非副溶血弧菌中轉移

■ 陳營李云冰張文文譚鮮英（ 廣州利洋水產科技股份有限公司 煙臺大學）

PirAB毒力正在向親緣關系較遠的非副溶血弧菌中轉移

■ 陳營12李云冰1張文文1譚鮮英1（1 廣州利洋水產科技股份有限公司 2 煙臺大學）

副溶血弧菌是一種嗜鹽性海洋細菌，廣泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和魚、蝦、貝類動物中。在夏秋季，副溶血弧菌是全球沿海地區致人腹瀉的主要病原菌，在我國此菌也長期居于食物中毒已檢出致病菌的前列。近些年，在對蝦養殖中出現了一株特殊的副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus,Vp），由于攜帶1個約69kb的大質粒，使其完全不同于從臨床上和環境中分離的菌株。該菌株在質粒上有兩個與昆蟲致病相關的毒素基因pirA和pirB，它們分別表達1個13 kDa和50kDa的外毒素蛋白PirA和PirB，我們稱這個菌株為PirAB型副溶血弧菌（PirAB-Vp）。由于pirAB毒素基因在質粒上，通過質粒在細菌種內和種間的轉移，細菌可以獲得相應的毒力。Kondo等首次報道了PirAB毒力通過質粒向非副溶血弧菌中轉移的現象。他們在越南北部地區的病蝦中分離出1株弧菌KC13.17.5，通過對此菌株的基因組測序，發現它屬于哈維氏弧菌（V.harveyi）。隨后，Liu等在V.owensii中也檢測出pirAB毒素基因，這是1個與哈維氏弧菌親緣關系很近的1個弧菌新種。在此之后，我們也檢測出攜帶pirAB毒素基因的哈維氏弧菌，并在今年的檢測中發現了更多該毒力基因向其它弧菌、甚至腸道細菌轉移的現象。

本文分析了PirAB毒力向非副溶血弧菌轉移的現象以及PirAB非副溶血弧菌之間的親緣關系，希望為對蝦疾病的防控提供一定的理論指導。

表1 基于16S rDNA的PirAB非副溶血弧菌的親緣關系分析

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病蝦和水樣的采集

在養殖南美白對蝦發病時，采集病蝦的肝胰腺和水樣，接種TCBS平板。然后，送利洋公司研究所進行PirAB-Vp檢測。

1.1.2 病蝦和水體PirAB-Vp檢測

挑取TCBS平板上的單菌落或轉接的過夜培養物，煮沸法制備細菌基因組模板，采用PCR方法進行副溶血弧菌和pirA毒素基因的檢測，選取部分攜帶pirA毒素基因的非副溶血弧菌進行16S rDNA測序。

1.1.3 PirAB非副溶血弧菌的16S rDNA鑒定

采用細菌16S rDNA通用引物27F和1492R，進行PirAB非副溶血弧菌16SrDNA序列的PCR擴增。經上海美吉生物醫藥科技有限公司對16S rDNA序列進行部分測序后，在美國國家生物工程信息中心（NCBI）網站上進行Blast比對分析，確定分離菌株的最可能種屬。

1.1.4 分離菌株的親緣關系分析

采用歐洲生物信息學網站（EMBL）上的Clustal Omega軟件，以網上已知的哈維氏弧菌的16S rDNA序列（基因庫編號：NR_102976）為參照標準， 逐一對測定的16S rDNA部分序列與之進行比對分析，確定兩者之間的親緣關系大小。

2 結果

2.1 非副溶血弧菌pirA毒素基因的檢測及菌株的親緣關系分析

2015年10～11月共檢測出22株PirAB非副溶血弧菌；2016年4月檢測出23株，5月檢測出21株。對部分菌株進行了16S rDNA測序鑒定并進行親緣關系分析，見表1。

表2 部分PirAB非副溶血弧菌的來源與親緣關系分析

在鑒定的菌株中，主要為哈維氏弧菌及與其親緣關系較近的弧菌，如V.owensii、創傷弧菌（V.vulnificus）、V.shilonii，相似率由100%降至86.89%。也有親緣關系較遠的霍亂弧菌（V.cholerae）、腸桿菌（Enterobacter）、克雷伯氏菌（Klebsiella），相似率為92.32%～94.78%，。

2.2 PirAB毒力已經向親緣關系較遠的非副溶血弧菌中轉移

2015年10～11月鑒定的PirAB非副溶血弧菌均為哈維氏弧菌。而在今年4月開始出現V.owensii和創傷弧菌。到5月時，檢測出的PirAB非副溶血弧菌種類更多，親緣關系也更遠，相似率最低至92.32%。更重要的是，從檢測的樣本看，從肝胰腺檢測的菌株親緣關系相對較近，親緣關系較遠的菌株均是在水中檢出的。而且，除了1株克雷伯氏菌外，其余均來自廣西欽州地區的養殖水樣，詳見表2。

2.3 各地區PirAB非副溶血弧菌的檢出情況

2016年4～5月是PirAB-Vp檢出的高發期，pirA陽性菌株檢出率平均高達43.4%。其中，PirAB非副溶血弧菌為7.5%（另文發表）。在送檢的廣東、廣西、福建、海南、江蘇地區樣本中，均檢出PirAB非副溶血弧菌。其中，以福建、廣西、廣東、海南地區檢測率較高，江蘇的檢出率最低。廣西只在水中檢出，為最高值25%；福建只在肝胰腺檢出，為最高值26.9%。結果見圖1。

圖1 4月和5月各地區PirAB非副溶血弧菌的檢出情況

3 討論

迄今為止，在國內外僅見兩例關于PirAB毒力通過質粒向非副溶血弧菌中轉移的報道，所轉移的非副溶血弧菌為哈維氏弧菌和V.owensii，并無向其它更多弧菌轉移的報道。我們在2015年10～11月和2016年4～5月共檢測出66株PirAB非副溶血弧菌，獲得了很多關于PirAB毒力轉移的資料。

2016年4～5月是pirA陽性菌株檢出的高峰期，造成了攜帶pirAB毒素基因的質粒向副溶血弧菌和其他弧菌的廣泛轉移，使得PirAB非副溶血弧菌的檢出率高達7.5%。去年的檢測發現，PirAB毒力轉移僅局限于哈維氏弧菌。而到今年的4、5月份，PirAB毒力轉移的菌種更多、親緣關系更遠、危害更嚴重。

PirAB非副溶血弧菌在福建、廣西、廣東、海南地區檢測率較高，局地有高于25%的檢出率，表明毒素基因傳播較活躍。只在廣西地區的水樣和福建地區的蝦樣中檢出PirAB非副溶血弧菌，可能與這兩個地區分別采取的弧菌防控措施有關。江蘇地區的PirAB非副溶血弧菌檢出率很低，說明毒素基因傳播的環境相對比較局限或者養殖水體交換少。

從PirAB非副溶血弧菌的親緣關系上看，所有親緣關系較遠的菌株均來自養殖水體，說明毒素質粒在水中傳播的更廣泛、更頻繁。在一個地域內，水源可能是毒素質粒傳播和擴散的主要途徑。由于外界不利環境的脅迫，會加速毒素質粒在細菌群體間的轉移。霍亂弧菌、腸桿菌、克雷伯氏菌是常見的、人的腸道致病菌，這些潛在致病菌在水中出現，說明水體受污染的可能性很大，而這種污染加劇了毒素質粒的傳播。因此，搞清毒力基因的流行與傳播規律，控制質粒轉移，是防止PirAB毒力在弧菌中廣泛流行與傳播的關鍵。