加味六安煎對咳嗽變異性哮喘大鼠腫瘤壞死因子-a和白細胞介素-5的影響

霍婧偉　魏麗娜　茍旭蕾　張　媛　王東升　吳力群

加味六安煎對咳嗽變異性哮喘大鼠腫瘤壞死因子-a和白細胞介素-5的影響

霍婧偉魏麗娜茍旭蕾張媛王東升吳力群

目的 探討加味六安煎治療咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma,CVA)的作用機制.方法 將60只Wistar大鼠隨機分為正常對照組、模型組、孟魯司特鈉組、加味六安煎低、中、高劑量組.以卵蛋白、氫氧化鋁致敏并吸入卵蛋白激發法復制咳嗽變異性哮喘大鼠模型,觀察各組大鼠咳嗽次數、血清腫瘤壞死因子-a(tumor necrosis factor alpha,TNF-a)、白細胞介素-5(interleukin-5, IL-5)的含量及肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞(eosinophile,EOS)計數.結果 (1)咳嗽次數:CVA模型組較其余各組咳嗽次數明顯增加(P<0.001);與CVA模型組相比,各治療組咳嗽次數明顯減少(P< 0.05);(2)EOS計數:與正常組比較,其余各組支氣管肺泡灌洗液EOS計數明顯升高(P<0.05); (3)TNF-a值:CVA模型組與正常組比較,血清TNF-a值明顯增高(P<0.05),高劑量組與孟魯司特鈉組比較,無顯著性差異(P>0.05);(4)IL-5值:CVA模型組血清IL-5值較其余各組明顯升高(P<0.05);其中高劑量組血清IL-5值較其余各治療組比較降低最明顯(P<0.05).結論 加味六安煎對咳嗽變異性哮喘大鼠有較好的治療作用,其機制可能是通過降低CVA大鼠血清TNF-a、IL-5水平,改善CVA大鼠咳嗽癥狀、降低EOS數量,從而達到治療CVA的目的.

加味六安煎; 咳嗽變異性哮喘; 腫瘤壞死因子-a; 白細胞介素-5

咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma,CVA)是一種特殊類型的哮喘,咳嗽是其惟一或主要臨床表現,無明顯喘息、氣促等癥狀或體征,以刺激性干咳、日輕夜重、季節性加重為其重要特征[1].國內報道小兒CVA占兒童慢性咳嗽的35.4%[2],且約有30%患者可發展為典型哮喘[3],因此對于CVA的早期診斷及治療以防止其發展為典型哮喘有著重要意義.本病以咳嗽為主要表現,屬中醫學"咳嗽"范疇.加味六安煎為臨床常用治療痰濕咳嗽方劑,且療效顯著,本研究選用動物實驗方法進一步驗證其療效及探討咳嗽變異性哮喘的發病機制.

1　材料與方法

1.1實驗動物

健康4周齡雄性Wistar大鼠60只,體質量(100±10)g,北京維通利華實驗動物技術有限公司提供.

1.2藥物與試劑

加味六安煎顆粒(藥物組成:法半夏6 g、橘紅6 g、茯苓6 g、杏仁6 g、白芥子6 g、甘草3 g、海浮石20 g、葶藶子6 g、瓜蔞10 g、膽南星4 g、炒萊菔子10 g),低、中、高劑量組分別配制成濃度為0.74 g/mL、1.48 g/mL、2.22 g/mL的溶液,由北京中醫藥大學東方醫院提供;孟魯司特鈉(批號: J012036,杭州默沙東制藥有限公司,10 mg/片).

卵蛋白(ovalbumin,OVA)(批號:326A0510, Sigma公司);氫氧化鋁(批號:20131224,北京市化學試劑公司);辣椒素(純度>95%,批號:K1222058, Sigma公司);白細胞介素(interleukin,IL)-5試劑盒(批號:201408,北京賽馳生物技術有限公司);腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-a試劑盒(批號:201409,北京福瑞生物工程公司).

1.3造膜與分組

將60只健康大鼠隨機分為6組(正常對照組、CVA模型組、孟魯司特鈉組、加味六安煎低劑量組、加味六安煎中劑量組、加味六安煎高劑量組),每組10只.參照參考文獻的方法復制[4],采用OVA和氫氧化鋁激發致敏并用卵蛋白激發的方法復制CVA模型大鼠.除正常對照組外,其余各組大鼠均在第1、8天腹腔注射10%卵蛋白和Al(OH)3混合溶液1 mL致敏.從第15天起,CVA模型組、孟魯司特鈉組、加味六安煎低劑量組、加味六安煎中劑量組、加味六安煎高劑量組大鼠置于密閉有機玻璃罩內,給予含1%OVA溶液的生理鹽水超聲霧化激發20分鐘,每天1次,共10天.

模型評估:激發時觀察大鼠反應,如出現咳嗽、豎毛、呼吸困難、噴嚏、干嘔、極度煩躁等現象中兩種或兩種以上者,或抽搐、虛脫現象之一者,判定為造模成功.

1.4給藥

給予含1%OVA溶液的生理鹽水超聲霧化激發前30分鐘,孟魯司特鈉組、加味六安煎低劑量組、加味六安煎中劑量組、加味六安煎高劑量分別灌胃給藥干預,其余2組分別給予同等劑量生理鹽水.第26天,進行咳嗽次數測定,腹主動脈取血分離血清進行TNF-a、IL-5細胞因子水平的測定.

1.5咳嗽次數測定

造模第26天,將大鼠放置在密閉玻璃罩內,霧化吸入10-4mol/L辣椒素溶液,然后關掉霧化器,再在玻璃罩內停留60秒,揭開蓋子,手背觸摸感受大鼠腹肌抽搐次數記錄2分鐘內咳嗽次數.

1.6血清中TNF-a、IL-5水平

治療結束后,先將大鼠禁食(可自由飲水)24小時,稱量各組大鼠體重,然后打開腹腔,腹主動脈取血4 mL,標本由無菌干燥管收集,靜置1小時后, 4℃2000 rpm離心10分鐘,分離血清,-20℃以下保存.采用ELISA方法測定血清TNF-a、IL-5的含量.

1.7肺泡灌洗液嗜酸性粒細胞計數

大鼠腹主動脈采血,消毒后打開胸腔,從氣管插管處注入5 mL生理鹽水,每次氣道內反復注入、回抽3次,獲得支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveotar lavage fluid,BALF),并以1000 rmp離心10分鐘,轉移上清液,將沉淀涂片,進行瑞氏染色,高倍鏡下進行嗜酸性粒細胞(eosinophile,EOS)計數.在顯微鏡下對連續視野中每200個細胞中嗜酸細胞計數.

1.8統計學處理

采用SPSS 20.0統計分析軟件,計量資料以均數±標準差表示,咳嗽頻次、TNF-a、IL-5及肺泡灌洗液嗜酸性粒細胞計數均服從正態分布,咳嗽頻次方差齊,因此采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法;TNF-a、IL-5及肺泡灌洗液嗜酸性粒細胞計數方差不齊,因此用Games-Howell法進行兩兩比較,所有的統計檢驗均采用雙側檢驗,P<0.05為差異有統計學意義.

2　實驗結果

2.1體征觀察

正常組大鼠呼吸平穩,行動靈活,反應靈敏,體重增長穩定,毛色光澤.其余組大鼠在激發前呼吸平穩,個別大鼠體重增長緩慢,毛色失去光澤.激發后出現咳嗽、噴嚏、口鼻分泌物增多、呼吸加快等.實驗結束時,各組大鼠死亡數量分別為:CVA模型組、加味六安煎中、高劑量組各1只(CVA模型組1只為互相咬食致死,加味六安煎中、高劑量組各1只為取血前注射鎮靜藥致死).

2.2咳嗽次數測定結果

經單因素方差分析,F=4.640,P<0.01,可以認為6組咳嗽頻次不全相同,與正常組比較,CVA模型組咳嗽次數明顯增加,有顯著統計學差異(P<0.001);與CVA模型組相比,各治療組咳嗽次數明顯減少(P<0.05);各藥物治療組間咳嗽次數無顯著性差異(P>0.05).見表1.

2.3各組大鼠血清TNF-a檢測結果

與正常組比較,CVA模型組血清TNF-a值明顯增高,具有顯著性差異(P<0.05);與CVA模型組比較,各治療組血清TNF-a明顯降低,具有顯著性差異(P<0.05);加味六安煎中藥各劑量組間比較,加味六安煎高劑量組與低、中劑量組比較有顯著性差異(P<0.05);孟魯司特鈉組、加味六安煎中、低劑量組間無顯著差異(P>0.05).加味六安煎高劑量組與孟魯司特鈉組比較,無顯著性差異(P>0.05).見表1.

表1　各組大鼠咳嗽次數、TNF-a、IL-5及EOS計數比較

2.4 各組大鼠血清IL-5檢測結果

與正常組比較,CVA模型組血清IL-5值明顯升高,具有顯著性差異(P<0.05);與模型組相比,各治療組血清IL-5明顯降低,具有顯著性差異(P<0.05);與孟魯司特鈉組比較,加味六安煎中、低劑量組無顯著性差異(P>0.05);加味六安煎高劑量組血清IL-5值明顯降低,有顯著性差異(P<0.05).見表1.

2.5肺泡灌洗液嗜酸性粒細胞計數

與正常組比較,CVA模型組肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞數量明顯增高,具有顯著性差異(P<0.05),說明CVA模型組有嗜酸性粒細胞參與的氣道炎癥,孟魯司特鈉組與加味六安煎中、高劑量組間無明顯差異(P>0.05),但治療后各組間與正常組仍有顯著性差異(P<0.05).見表1.

3　討論

咳嗽變異性哮喘,歸屬于中醫學"咳嗽"范疇.小兒具有"肺常不足,脾常虛"的生理特點,且咳嗽變異性哮喘病程較長,病情易反復,日久肺脾氣虛證多見.其病機主要是肺脾氣虛導致痰濕內伏,復感外邪觸發致使痰阻氣道,肺失宣肅、肺氣上逆而發,方藥選用六安煎加味.六安煎出自《景岳全書.新方八陣》,由半夏、陳皮、茯苓、甘草、杏仁、白芥子六味藥物組成,半夏燥濕化痰,凈貯痰之器,茯苓健脾滲濕杜生痰之源,杏仁降氣止咳,白芥子利氣豁痰,全方達到健脾化痰,降氣止咳功效.正所謂脾為生痰之源,肺為貯痰之器,如此肺脾同治則痰消咳止.現代醫學認為該病發病機制與典型哮喘相似,是由多種炎性細胞(如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等)共同參與的氣道慢性炎癥引起的氣道高反應.EOS是誘導支氣管黏膜損傷的主要效應細胞,EOS的主要殺傷機制是釋放4種顆粒蛋白,還能產生細胞因子和炎癥介質.近年研究發現IL-5受體特異的表達于嗜酸和嗜堿性粒細胞上,IL-5對EOS的增殖、分化、存活及活化起著重要作用[5].TNF-a可趨化嗜酸性粒細胞、中性粒細胞釋放炎癥介質,誘發或加重哮喘,最終使氣道痙攣,血管通透性增加,微血栓形成,氣道黏膜水腫等,導致哮喘發作[6].目前孟魯司特鈉已被GINA方案中推薦用于治療各種程度的哮喘,能夠有效預防和抑制氣道嗜酸粒細胞浸潤及支氣管痙攣,減輕氣道炎癥反應和黏膜水腫,減少氣道分泌物,改善氣道高反應性,達到預防和治療哮喘目的[7].

本實驗結果顯示咳嗽變異性哮喘大鼠模型外周血清中TNF-a、IL-5及肺泡灌洗液中EOS數量明顯高于正常大鼠,能夠反映氣道的炎癥反應.在應用孟魯司特鈉及加味六安煎治療后,各組大鼠咳嗽次數、EOS數量均較前模型組減少,且各組間無明顯差異.TNF-a及IL-5水平,經治療后各組水平均有明顯下降,其中加味六安煎高劑量組與孟魯司特鈉組下降最明顯,無明顯差異.本研究結果提示加味六安煎可有效減輕咳嗽變異性哮喘大鼠咳嗽次數,降低氣道反應性,推測其可能作用機制之一為通過調節體內TNF-a及IL-5的含量,降低EOS的水平,從而減輕氣道炎性反應,以達到治療咳嗽變異性哮喘的目的.

[1] 2009年中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組.咳嗽的診斷與治療指南[J].中華結核和呼吸雜志,2009,32(6):407-413.

[2] 劉秋海,徐浩岑,邢燕如,等.咳嗽變異性哮喘在兒童慢性咳嗽中發病率的調查研究[J].中國醫刊,2014,(6):67-69.

[3] Nakajima T,Nishimura Y,Nishiuma T,et al.Characteristics o patients with chronic cough who developed classic asthma during the course of cough variant asthma:a longitudinal study[J]. Respiration,2005,72(6):606-611.

[4] Nishitsuji M,Fujimura M,Oribe Y,et al.Aguinea pig model for cough variant asthma and role of tachykinins[J].Exp Lung Res JT-Experimental lungResearch,2004,30(8):723-737.

[5] Lampinen M,Carlson M,Hakansson L D,et a1.Cytokine regulated accumulation of eosinophils in inflammatory disease[J]. Allergy,2004,59(8):793-805.

[6] 李迎利,尚寧,周民偉.透明質酸對支氣管哮喘患者嗜酸細胞的影響[J].臨床肺科雜志,2001,6(1):15.

[7] 周衛衛,凌杰.孟魯司特對哮喘患兒血清白三烯C4和尿白三烯E4水平的影響及療效觀察[J].中國藥物與臨床,2013,13 (11):1459-1460. (收稿日期:2015-06-24)

(本文編輯:董歷華)

The effect of Jiawei Liuan decoction on TNF-a and IL-5 in cough variant asthma rats

HUO Jing-wei,WEI Li-na,GOU Xu-lei,et al. Department of pediatrics Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100078,China
Corresponding author:WU Li-qun,E-mail:wulq1211@163.com

Objectives To observe the effect of Jiawei Liuan decoction on blood serum level of TNF-a and IL-5,and eosinophil(EOS)level in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)in cough variant asthma(CVA)rats,thereby determining the mechanism of Jiawei Liuan decoction in CVA treatment. Methods 60 Wistar rats are randomly allocated into normal control group(NCG),CVA group(CVAG), montelukast sodium group(MSG),Jiawei Liuan low dose group(LALG),Jiawei Liuan medium dose group(LAMG)and Jiawei Liuan high dose group(LAHG).CVA rat models are hypersensitized by albumin and aluminium hydroxide.The rats are made to inhale albumin to activate the replication of CVA rat models.Cough frequencies,blood serium TNF-a and IL-5 levels,as well as BALF EOS levels are observed.Results Cough frequency:CVAG experienced increased cough frequency as compared to other groups(P<0.001),cough frequencies of all groups are significantly lower as compared to CVAG(P<0. 05).Eosinophil count:BALF EOS of all groups are significantly increased as compared to NCG(P<0. 05).TNF-a levels:CVAG blood serium TNF-a is significantly increased(P<0.05),there is no significant difference between LAHG and MSG(P>0.05).IL-5 levels:CVAG blood serum IL-5 are significantly increased as compared to other groups(P<0.05),IL-5 blood serum was significantly decreased in LAHG as compared to other trearment groups(P<0.05).Conclusions Jiawei Liuan decoction has prominent therapeutic effect for CVA rats.The mechanism involved could be that it is able to decrease the blood serum TNF-a,IL-5 levels,decrease cough symptoms and decrease BALF EOS level in CVA rats in order to achieve therapeutic effect.

Jiawei Liuan decoction; Cough variant asthma; Tumor necrosis factor alpha; Interleukin-5

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.01.002

北京中醫藥大學自主選題(2013-QNJSZX018)

100078 北京中醫藥大學東方醫院兒科(霍婧偉、吳力群);北京中醫藥大學第二臨床醫學院[魏麗娜(碩士研究生)、茍旭蕾(碩士研究生)、張媛(碩士研究生)、王東升(碩士研究生)]

霍婧偉(1984-),女,碩士,主治醫師.研究方向:中醫藥治療小兒呼吸系統疾病.E-mail:huo_jing _wei@126.com

吳力群(1965-),女,博士,主任醫師,教授,碩士生導師.研究方向:中醫藥治療小兒肺系、腎系疾病.E-mail:wulq1211@163.com