AEG1與鈣黏附蛋白E在食管癌中表達的相關性及其意義

趙潤根，張彩鳳，姬娟娟，張利利，肖懷蔥，夏永華，韓宇（新鄉醫學院第一附屬醫院.消化內科，.皮膚科，河南 衛輝 45300）

AEG1與鈣黏附蛋白E在食管癌中表達的相關性及其意義

趙潤根1，張彩鳳1，姬娟娟1，張利利1，肖懷蔥1，夏永華2，韓宇1
（新鄉醫學院第一附屬醫院1.消化內科，2.皮膚科，河南 衛輝 453100）

目的研究星形細胞上調基因1（AEG1）和鈣黏附蛋白E（E-cad）在食管癌中的表達的相關性，并分析與臨床病理特征的關系。方法采用免疫組織化學方法和Western blot兩種方法檢測58例食管癌組織及其相應的癌旁組織中AEG1和鈣黏附蛋白E的表達，并分析與臨床病理特征的相關性。結果在58例食管癌組織中AEG1表達的陽性率82.7%明顯高于相應的癌旁組織的51.7%（P<0.05），且表達陽性率與性別、年齡、腫瘤的部位、腫瘤病理類型無相關性（P>0.05），而與腫瘤分化程度、浸潤深度、臨床分期、淋巴結轉移相關（P< 0.05）；在58例食管癌組織中鈣黏附蛋白E的陽性率為31%，明顯低于相應癌旁組織的94.8%（P<0.05），且表達陽性率與性別、年齡、腫瘤的部位、腫瘤病理類型無相關性（P>0.05），而與腫瘤分化程度、浸潤深度、臨床分期、淋巴結轉移相關（P<0.05）；食管癌中AEG1與鈣黏附蛋白E的表達呈明顯的負相關（r=-0.483，P<0.05）。結論AEG1和鈣黏附蛋白E在食管癌中的表達分別表現為高表達和表達缺失，且兩者與食管癌的侵潤、轉移密切相關，AEG1可能介導食管癌中鈣黏附蛋白E的表達下調。

星形細胞上調基因1；鈣黏附蛋白E；食管癌；免疫組織化學

食管癌是我國常見的惡性腫瘤，由于早期癥狀不典型，多數患者發現時已屬晚期，具有較高的死亡率，居全國各類惡性腫瘤的第4位[1]，其中深度浸潤和轉移是主要的死因。目前對于食管癌的治療除傳統的外科手術、放化療治療外，隨著人們對腫瘤發病的分子水平的研究不斷加深，針對新分子靶點的分子靶向治療成為食管癌治療的新方向。星形細胞上調基因1（astrocyte elevated gene 1，AEG1）是新近發現的癌基因。研究發現AEG1在多種腫瘤（如乳腺癌[2]、神經膠質瘤[3]、前列腺癌[4]、胃癌等[5]）中存在高表達，并與腫瘤的進展、轉移與侵襲、不良預后密切相關[6-7]。鈣黏附蛋白E（E-cadherin，E-cad）是表達于正常上皮細胞表面的黏附分子，介導上皮細胞間的黏附性。E-cad在多種腫瘤中存在明顯表達減少甚至缺失，與腫瘤的轉移與侵襲、不良預后密切相關[8]。然而兩者在食管癌中表達的相關性并未見報道。本研究擬通過免疫組織化學和Western blot檢測食管癌及相應癌旁食管黏膜中AEG1和E-cad表達水平，并分析兩者與臨床病理特征的關系，探討兩者在食管癌中表達的相關性及其意義。

1　材料與方法

1.1組織材料

選取58例新鄉醫學院第一附屬醫院胃鏡室取得的食管癌病理活檢標本，所有標本均經2位高年資病理科醫師確診；所有患者均為首次就診，均未接受治療。

1.2試劑與儀器

鼠多克隆AEG1抗體（稀釋倍數1∶100）和鼠多克隆鈣黏附蛋白E抗體（稀釋倍數1∶100）、DAB顯色劑均購自武漢博士德生物有限公司，免疫組織化學SP法二抗試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司，改進型枸櫞酸鹽緩沖抗原修復液（50×）購自碧云天生物科技有限公司，蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒、凝膠試劑盒、山羊抗鼠二抗、ECL顯色液均購自碧云天生物科技有限公司，組織包埋機（湖北孝感，BM-IX）；石蠟切片機（上海Thermo Shadon，Finesse 325）；Amersham Imager 600凝膠成像系統（美國 GE Healthcare），垂直電泳系統（美國Bio-rad）。

1.3方法與結果判定

1.3.1免疫組織化學將取得的組織標本用4%中性甲醛固定，進行石蠟包埋切片。常規脫蠟復水、微波法抗原修復、過氧化氫中和內源性的過氧化氫酶、山羊血清封閉、滴加一抗、4℃過夜、滴加二抗、滴加生物素-卵鏈霉素蛋白、DAB顯色、復染、中性樹膠封片、觀察。用PBS代替一抗作為陰性對照。對于陽性染色結果的判定采用雙盲法進行，由2位高年資病理科醫師獨立讀片。AEG1陽性表達主要定位于細胞質，少量表達于細胞膜，陽性表達為棕黃色顆粒。每張切片隨機挑選5個視野（×400），每個視野計數100個完整的腫瘤細胞，先根據陽性細胞所占的百分數計分：<5%為0分，5%～25%為1分,26% ～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；再根據陽性細胞著色程度計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，褐黃色為3分.將兩者相乘所得的總分進行結果判定：分別對應4種表達強度：陰性：-（評分0～1）、弱陽性：+（評分2～4）、中度陽性：++（評分5～8）和強陽性：+++（評分9～12）；（＋～＋＋＋）統計為陽性，（－）為陰性。

1.3.2免疫蛋白印跡對新鮮的食管癌組織和癌旁組織標本進行總蛋白的提取并定量；將蛋白用8% 的SDS-PAGE膠電泳，電泳后取下凝膠將蛋白電轉到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗（AEG1和E-cad濃度均為1∶670）4℃過夜；第2天加入二抗，室溫孵育1 h，在Amersham Imager 600化學發光成像系統曝光，蛋白表達的灰度值運用mage-Pro Plus 5.0軟件分析。蛋白相對表達為目的基因表達量與內參基因表達量的比值，Gapdh為內參。

1.4統計學方法

采用SPSS 11.5統計軟件進行數據分析，計數資料用χ2檢驗或Fisher's精確檢驗，相關性用Spearman等級相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1AEG1和E-cad在食管癌組織和癌旁組織中的表達

AEG1在食管癌組中表達的陽性率明顯高于癌旁組，兩者比較差異有統計學意義（P<0.05）。與癌旁組比較，食管癌中E-cad的表達明顯減少，差異有統計學意義。見圖1和表1。

2.2AEG1和E-cad在食管癌組織中表達的相關性

AEG1陽性組中E-cad陽性率為20.8%，明顯低于AEG1陰性組中E-cad的陽性率83.3%；兩者在食管癌中的表達呈明顯負相關（r=-0.483），差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

圖1　AEG1和E-cad在食管癌及癌旁組織中的表達

表1　AEG1、E-cad在食管癌及其癌旁組織中的表達情況

表2　AEG1與E-cad在食管癌中表達的相關性

2.3AEG1和E-cad在食管癌中表達與臨床病理因素之間的關系

食管癌組織中AEG1的表達與患者的性別、年齡、腫瘤的部位及病理類型無關（P>0.05）；而與腫瘤的分化程度、侵潤深度、淋巴結轉移情況、臨床分期相關（P<0.05），隨著分化程度的降低、浸潤深度的加深，AEG1的表達陽性率越高，有淋巴轉移的患者中AEG1的陽性率明顯高于無淋巴結轉移的患者。食管癌組織中E-cad的表達與患者的性別、年齡、腫瘤的部位及病理類型無相關性（P>0.05）；而與腫瘤的分化程度、侵潤深度、淋巴結轉移情況、臨床分期相關（P<0.05），隨著分化程度的降低、浸潤深度的加深，E-cad的表達陽性率逐漸降低，有淋巴轉移的患者中E-cad的陽性率明顯低于無淋巴結轉移的患者。見表3。

2.4食管癌和癌旁組織中AEG1和E-cad蛋白表達水平的比較

食管癌和癌旁組織中AEG1和E-cad蛋白表達水平的比較見圖2、3、4。食管癌中AEG1蛋白表達水平明顯高于相應的癌旁組織（P<0.05），食管癌組織中E-cad的表達水平明顯低于相應的癌旁組織（P<0.05），兩者差異有統計學意義。見圖5、6。

圖2　AEG1、鈣黏附蛋白E在食管癌與相應的癌旁組織中的表達情況

表3　AEG1、E-cad在食管癌中的表達與臨床病理因素之間的關系

圖3　食管癌與相應的癌旁組織中AEG1表達的比較

圖4　食管癌與相應癌旁組織中的E-cad表達的比較

圖5　食管癌與癌旁組織中AEG1含量的比較

圖6　食管癌與癌旁組織中E-cad含量的比較

3　討論

AEG1是新近發現的原癌基因，其cDNA序列全長3 611 bp，包含12個外顯子和11個內含子，位于人類8號染色體上[9]。大量研究表明，AEG1有促進腫瘤細胞的增殖[10]、抑制細胞凋亡[11]、促進細胞侵襲和轉移、增加化療抗性[12]、促進腫瘤血管形成等[13]生物學功能。提示AEG1在腫瘤的發生、發展及惡性進程中發揮重要作用。近年來的研究發現，神經膠質瘤[3]、前列腺癌[4]、胃癌[5]、卵巢癌等[14]多種腫瘤中都存在AEG1的高表達。為研究食管癌中AEG1的表達情況，本實驗采用免疫組織化學和Western blot方法對58例食管癌組織和相對應的癌旁組織中AEG1的表達情況進行檢測。結果顯示食管癌組織中AEG1的表達陽性率明顯高于相對應的癌旁組織（P<0.05），兩者比較差異有統計學意義。為進一步探討AEG1在食管癌中表達的意義，本研究比較分析58例食管癌患者的臨床病理資料。

浸潤和轉移是導致腫瘤患者死亡的主要原因，浸潤深度和遠處轉移與患者的不良預后密切相關[15]。研究證實，AEG1能促進乳腺癌細胞轉移到小鼠的肺部[16]，在轉移的淋巴結中AEG1表達水平明顯高于無淋巴結轉移的腫瘤組織[13]；AEG1的表達可以明顯抑制腫瘤組織向淋巴結的轉移[12]。這提示AEG1在腫瘤細胞的浸潤和轉移密切相關。本研究比較分析58例食管癌標本，其中浸潤深度在T1-T2之間的病例25例，AEG1的陽性率為64.0%，顯著低于浸潤深度在T3-T4的97.0%（P=0.01）。其中有淋巴結轉移的患者38例，AEG1的陽性率為97.4%，顯著高于無淋巴結轉移的55.0%（P=0.00），也支持這一觀點。同時本研究還發現在食管癌組織中AEG1的表達與腫瘤的分化程度和臨床分期密切相關（P<0.05），而與腫瘤的部位、病理類型、患者的年齡及性別無關。其具體分子機制目前尚不清楚。

腫瘤細胞的轉移是一個多階段的過程[17]。目前多數研究表明，腫瘤細胞的轉移的發生起始于上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[18]，EMT的過程包括細胞表面的緊密連接蛋白減少或重新排列以及一些間質細胞蛋白的表達的增多；從而導致細胞失去上皮極性并獲得間質特性，使細胞獲得較強的侵襲和轉移能力。鈣黏附蛋白E是一種鈣依賴性的細胞跨膜蛋白；其功能的發揮主要是E-cad與β連環素結合形成E-cad/β連環素復合體，錨定于細胞骨架上，從而介導同種細胞間的黏附并維持組織結構的功能。研究證實，E-cad在包括食管癌在內的多種腫瘤中都存在表達的缺失，并與腫瘤的浸潤深度和遠處轉移密切相關[19]。本研究通過對58例食管癌標本中鈣黏附蛋白E的表達進行比較分析發現，在AEG1表達陽性的48例標本中僅有10例出現E-cad的陽性，陽性率為20.8%；而在AEG1表達陰性的10例食管癌標本中8例鈣黏附蛋白E表現為陽性，陽性率為80%；相關分析結果顯示，AEG1和E-cad在食管癌的表達中呈明顯負相關（r=-0.483，P=0.00），差異有統計學意義。另外，在實驗中還發現在食管癌標本中隨著AEG1陽性程度的增強，E-cad表達水平相應的降低，因此可推測AEG1在食管癌中的過表達可能通過某種通路下調E-cad的表達。有文獻報道，在肺癌[20]、宮頸癌等[18]的研究中發現AEG1表達上調具有誘導上皮細胞間質化的生物功能，其中Wnt/β-catenin信號通路在此過程中發揮重要作用。其可能的機制為AEG1通過激活酪蛋白激酶（CKIδ）從而誘導糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）的磷酸化激活Wnt/β-catenin信號通路，導致細胞中β-catenin水平表達下降，介導上皮細胞的表面黏附分子的表達。這與本結果相一致。

研究表明，在食管癌中分別存在AEG1的表達上調和E-cad的表達缺失，且其表達水平與食管癌的分化程度、浸潤深度、轉移情況密切相關；AEG1和E-cad有望成為評估食管癌患者轉移和浸潤的重要生物指標。相關分析顯示兩者在食管癌中表達呈顯著負相關。AEG1可能通過Wnt/β-catenin信號通路介導E-cad的表達下調，在食管癌的局部浸潤和轉移中發揮重要作用。然而在本研究中還有諸多不足之處，還需要進一步研究驗證。

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（張蕾編輯）

臨床論著

Correlationship and significance ofAEG1and expression of E-cad in esophageal carcinoma

Run-gen Zhao1，Cai-feng Zhang1，Juan-juan Ji1，Li-li Zhang1，Huai-cong Xiao1，Yong-hua Xia2，Yu Han1
（1.Department of Gastroenterology；2.Department of Dermatology，the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University，Weihui，Henan 453100，China）

Objective To explore the correlationship of astrocyte elevated gene 1（AEG1）and expression of E-cadherin（E-cad）protein in esophageal carcinoma，and analyze its relationship with clinical pathological features. Methods Immunohistochemical and Western Blot test methods were used to detect the expression ofAEG1and E-cadherin protein in 58 cases of esophageal carcinoma tissues and its corresponding adjacent tissues.Then we analyzed the relationship ofAEG1，E-cadherin and clinicopathologic correlation.Results In 58 cases of esophageal carcinoma tissues，the positive expression rate ofAEG1was 82.7%；The positive expression rate ofAEG1was 51.7 %in the corresponding adjacent tissues，the positive expression rate ofAEG1in esophageal carcinoma tissues was obviously higher than that in the corresponding adjacent tissues（P＜0.05），and the expression positive rate ofAEG1 in esophageal carcinoma tissues was related to differentiated degree，depth of invasion，clinical stage，and lymph node metastasis（P＜0.05）；but no relation with sex，age，tumor site，and pathologic types（P＞0.05）；in 58 cases of esophageal carcinoma tissues，the positive expression rate of E-cadherin protein was 31%，the positive expressionrate of E-cadherin was 94.8%；the positive expression rate of E-cadherin in esophageal carcinoma tissues was obviously less than that in the corresponding adjacent tissues（P＜0.05）；It is related to differentiated degree，depth of invasion，clinical stage，and lymph node metastasis（P＜0.05）；but no relation with sex，age，tumor site，and pathologic types（P＞0.05）；the expression ofAEG1and E-cadherin protein was significantly negative correlation（r=0.483，P＜0.05）. Conclusions The expression ofAEG1and E-cadherin in esophageal carcinoma was characterized by over-expression and loss-expression，and they were closely associated with invasion and metastasis of esophageal carcinoma，AEG1may be mediated E-cadherin less-expression in esophageal carcinoma.

astrocyte elevated gene1；E-cadherin；esophageal carcinoma；immunohistochemistry

R 735.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.04.007

1005-8982（2016）04-0033-06

2015-10-28

韓宇，E-mail：hy198317@126.com，Tel：13837315730