不同劑量肝素對高糖誘導后的人腹膜間皮細胞水通道蛋白1表達的影響

李鴿，趙久陽，任澤銀，肖偉，桂永豐（.湖南省常德市第一人民醫院 腎病內科，湖南 常德，45000；.大連醫科大學附屬第二醫院 腎內科，遼寧 大連 6000）

論著

不同劑量肝素對高糖誘導后的人腹膜間皮細胞水通道蛋白1表達的影響

李鴿1，趙久陽2，任澤銀1，肖偉1，桂永豐1
（1.湖南省常德市第一人民醫院 腎病內科，湖南 常德，415000；2.大連醫科大學附屬第二醫院 腎內科，遼寧 大連 116000）

目的研究不同劑量肝素對高糖誘導后的人腹膜間皮細胞水通道蛋白1（AQP1）mR NA和蛋白表達水平的影響。方法分離并培養人腹膜間皮細胞，并用高糖（2.5%葡萄糖溶液）誘導4、8、12和24h；采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（R T-PCR）檢測AQP1 mR NA的表達水平，從而確定表達量達峰值的誘導時間。將不同劑量的肝素添加至人腹膜間皮細胞培養液中，并經2.5%高糖溶液誘導后，用R T-PCR及免疫組織化學法檢測實驗組與對照組AQP1 mR NA和蛋白表達水平。結果與對照組比較，實驗組AQP1 mR NA和蛋白表達明顯增加，且mR NA表達呈時間依賴性，且在高糖誘導24h時表達量達峰值，差異有統計學意義（P<0.05）；R T-PCR與免疫組織化學結果具有一致性，均提示AQP1mR NA和蛋白表達水平在2.5%葡萄糖+1.5×10-2mg/ml肝素組呈現明顯上調，差異有統計學意義（P<0.05）；免疫組織化學染色提示2.5%葡萄糖+1.5×10-2mg/ml肝素組細胞可見胞核及胞漿有空泡樣改變。結論肝素在高糖環境中誘導24h后可顯著增加人腹膜間皮細胞水通道蛋白AQP1 mR NA和蛋白的表達，且大劑量的肝素能使胞漿及胞核出現明顯的空泡樣改變。

肝素；人腹膜間皮細胞；水通道蛋白1

腹膜透析是終末期腎衰竭患者可供選擇的治療方法之一，但臨床上腹膜透析患者常發生腹膜透析管堵塞，為解決該問題，體內外抗凝劑肝素常添加于腹膜透析液中。有研究顯示，大劑量肝素添加于含葡萄糖的腹膜透析液中可使腹膜透析的超濾量增加[1]，但肝素是否通過影響腹膜間皮細胞中水通道蛋白1 （aquaporin 1，AQP1）的表達來實現的，國內外未見相關報道，故本實驗探討不同劑量肝素對高糖誘導后人腹膜間皮細胞水通道蛋白AQP1表達的影響。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

1.1.1主要試劑TRIzol試劑盒為美國Invitrogen公司產品，逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒及焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）水為寶生物工程（大連）有限公司產品，鼠抗人細胞角蛋白單抗、二氨基聯苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色液、免疫組織化學法SP試劑盒，均為北京中杉金橋生物技術有限公司產品，鼠抗人波形蛋白抗體、抗白細胞CD45抗體、抗第Ⅷ因子相關抗原抗體均為武漢博士德生物技術有限公司產品，AQP1一抗為美國Santa Cruz公司產品，細胞消化液[0.125%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）-2Na]為美國Sigma公司產品，1640培養液為美國Invitrogen公司產品，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）為天津TBD公司產品，D-葡萄糖、氯仿、異丙醇等分析純購自天津市科密歐化學試劑有限公司，肝素鈉注射液（12 500 u/2 ml，12500u相當于100 mg）購自江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司，PBS液、D-Hank平衡鹽溶液為本實驗室自行配置，過濾滅菌分裝，室溫保存。

1.1.2主要儀器二氧化碳CO2培養箱及高速臺式冷凍離心機為德國賀力式公司生產，垂直層流潔凈工作臺為上海上凈凈化設備有限公司生產，紫外可見分光光度計（型號UV-9100）為北京瑞利分析儀器公司生產，紫外分析儀（型號WFH-201）購自溫州市孚華分析儀器廠，倒置相差顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，凝膠成像分析系統購自美國Pharmacia Biotech公司，水平電泳槽購自北京市六一儀器廠，PCR儀購自美國Biometra公司。

1.2人腹膜間皮細胞的分離、培養與鑒定

本實驗從連續性腹膜透析患者透出液中分離并提取人腹膜間皮細胞，無菌條件下收集患者流出液標本，4℃、1200r/min離心5min。D-Hank平衡鹽溶液洗滌沉淀3次，將細胞接種于含10%（V/V）胎牛血清的1640培養液中，置于二氧化碳CO2培養箱37℃培養。每3天換液1次。原代培養的人腹膜間皮細胞最初呈多形性，星狀及梭狀占多數。待細胞生長融合后形成典型的鋪路石樣外觀（見圖1），這與周循等人描述的人腹膜間皮細胞形態一致[2]。用0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA 2 ml混合液消化細胞，吸管吹打均勻，使細胞密度保持在1×105～1× 106個/ml。第2代細胞用于形態學及免疫組織化學鑒定，第3代細胞進行實驗研究。免疫組織化學法顯示，抗細胞角蛋白抗體陽性、抗波形蛋白抗體染色陽性（見圖2、3），抗第Ⅷ因子抗體和抗白細胞CD45抗體染色陰性（見圖4、5），由此可排除血管內皮細胞、成纖維細胞等[3-4]，證明其是腹膜間皮細胞。

圖1　人腹膜間皮細胞 （×400）

圖2　細胞角蛋白陽性 （×100）

圖3　細胞波形蛋白陽性 （×100）

圖4　第Ⅷ因子相關抗原陰性 （×100）

圖5　白細胞CD45抗原陰性 （×100）

1.3經2.5%高糖誘導后AQP1 mRNA表達水平呈時間依賴性

將3次傳代后的人腹膜間皮細胞均勻接種于6孔培養板上，用無血清的1640培養液同步消化24 h。無菌稱取葡萄糖2.5 g，溶于100 ml無菌三蒸水中，配置成2.5%高糖溶液。將2.5%高糖添加于細胞培養液中，分別誘導4、8、12和24 h，比較誘導不同時間后AQP1 mRNA的表達水平。提取細胞總RNA，在6孔細胞板內加入1 ml TRIzol，輕輕吹打數次，收集細胞于2 ml離心管內（德國Eppendorf公司），室溫靜置5min。加入氯仿200μl，振蕩充分搖勻，室溫靜置5min，4℃、1000r/min離心10min。加入與上清液等體積的異丙醇，上下混勻，室溫靜置5min，4℃、1200r/min離心10min。用75%乙醇1 ml清洗沉淀，4℃、1 200 r/min離心5 min，棄上清留沉淀，室溫干燥。用8μl DEPC處理水溶解沉淀。取2μl RNA樣本，在紫外分光光度計下測量260和280nm下光密度（optical density，OD）值，A260/A280值在1.8～2.0。凝膠成像儀下可見28、18和5S 3條清晰的RNA帶，說明RNA無降解。cDNA的合成參照逆轉錄試劑盒操作程序進行。反應體系為10μl，反應條件為：37℃預變性10 min，42℃變性60 min，99℃延伸5min。引物序列從Genebank中查閱，采用Primer Premier 5軟件設計引物。β-actin（531bp）：正向引物5'-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3'，反向引物5'-GTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3'；AQP1 （336 bp）：正向引物5'-AGATCAGCATCTTCCGTG-3'，反向引物5'-AGTTGTGTGTGATCACCG-3'；PCR反應條件：94℃預變性3 min；55℃變性1 min；72℃延伸1min。反應后取5μl PCR產物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像分析系統中觀察并拍照。對圖像中的內參（β-actin）和目的基因（AQP1）的DNA條帶進行光密度分析，用AQP1光密度值/β-actin光密度值表示目的基因相對表達量。每組測3個數值，求平均數，然后進行統計學分析。

1.4RT-PCR檢測不同實驗組細胞AQP1基因表達水平

用一定劑量的無菌注射用水稀釋肝素鈉注射液（50 mg/ml），配置不同濃度的肝素溶液，并加入到細胞培養液中，用2.5%葡萄糖誘導細胞24 h；按照不同實驗要求隨機分為以下5組：①無葡萄糖無肝素對照組（對照組）；②2.5%葡萄糖組；③2.5%葡萄糖+ 2.5×10-3mg/ml肝素組；④2.5%葡萄糖+5.0×10-3mg/ml肝素組；⑤2.5%葡萄糖+1.5×10-2mg/ml肝素組。細胞RNA的提取、逆轉錄成cDNA，以及PCR擴增方法同1.3所述。

1.5免疫細胞化學法檢測AQP1蛋白表達

收集細胞，PBS沖洗3次，多聚甲醛冰上固定30min。PBS再次沖洗3次。自然風干后，用3%過氧化氫H2O2室溫避光孵育30 min，PBS沖洗3次。血清封閉非特異性抗原后，加Ⅰ抗AQP1多克隆抗體，4℃孵育過夜。加入生物素化Ⅱ抗，37℃孵育30min，PBS洗3次，加入鏈酶親合素-生物素-堿性磷酸酶復合物，37℃孵育30min，PBS洗3次。滴加DAB顯色液，鏡下觀察至出現棕黃色陽性信號后蒸餾水沖洗終止反應。蘇木素復染，碳酸鋰水溶液返藍，梯度乙醇逐級脫水，透明，過二甲苯溶液，中性樹膠封片，自然風干。每張切片隨機取5個視野光鏡拍照，用Image ProPlus6.0圖像分析軟件測出OD值，并計算平均光密度。著色越深，則OD值越大，表明該蛋白表達水平越高，比較對照組與實驗組不同劑量肝素對高糖誘導24 h后AQP1的蛋白表達水平差異是否具有統計學意義。

1.6統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，用重復測量設計的方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1RT-PCR反應

經2.5%葡萄糖誘導4、8、12和24 h后，人腹膜間皮細胞水通道蛋白AQP1的mRNA表達水平呈現出時間依賴性，誘導4、8、12和24 h后AQP1 mRNA表達比誘導前有上調（F=11.392，P=0.004），提示高糖可上調AQP1的表達。誘導24h時mRNA表達量比誘導4、8和12h增加（F=7.513，P=0.035），而誘導4、8和12 h組間比較，差異無統計學意義（F=0.121，P=0.623）（見圖6）。

2.5%葡萄糖組、2.5%葡萄糖+2.5×10-3mg/ml肝素組、2.5%葡萄糖+5.0×10-3mg/ml肝素組以及2.5%葡萄糖+1.5×10-2mg/ml肝素組與對照組比較，AQP1的mRNA表達比較，差異有統計學意義（F= 15.638，P=0.002）。而2.5%葡萄糖+2.5×10-3mg/ml肝素組與2.5%葡萄糖+5.0×10-3mg/ml肝素組中AQP1 mRNA的表達比較，差異無統計學意義（F= 1.085，P=0.533），而2.5%葡萄糖+1.5×10-2mg/ml肝素組較前3組可明顯增加腹膜間皮細胞上AQP1 mRNA的表達（F=10.473，P=0.027）（見圖7）。

2.2免疫組織化學法

實驗組與對照組中均有AQP1蛋白表達（見圖8、9）。與對照組比較，2.5%葡萄糖組、2.5%葡萄糖組+不同劑量肝素組的AQP1蛋白陽性表達明顯增高，差異有統計學意義（F=9.367，P=0.003），胞核上亦可見棕黃色深染顆粒；2.5%葡萄糖+1.5×10-2mg/ml肝素組與3組的AQP1表達比較，差異有統計學意義（F=7.421，P=0.016）；而2.5%葡萄糖組、2.5%葡萄糖+2.5×10-3mg/ml肝素組、2.5%葡萄糖+5.0×10-3mg/ml肝素組比較，差異無統計學意義（F=2.540，P=0.297）（見圖10～13）。2.5%葡萄糖+1.5×10-2mg/ml肝素組免疫組織化學染色可見胞核及胞漿有空泡樣變，而2.5%葡萄糖+常規劑量肝素組胞漿及胞核未見明顯空泡樣變。

圖6　AQP1 mRNA經高糖誘導后的時間依賴表達

圖7　不同劑量肝素+2.5%葡萄糖對AQP1 mRNA表達的影響

圖8　對照組AQP1蛋白表達陽性 （×400）

圖9　2.5%葡萄糖組AQP1蛋白表達陽性 （×400）

圖10　2.5%葡萄糖+2.5×10-3mg/ml肝素組AQP1蛋白表達陽性 （×400）

圖11　2.5%葡萄糖+5.0×10-3mg/ml肝素組AQP1蛋白表達陽性 （×400）

圖12　2.5%葡萄糖+1.5×10-2mg/ml肝素組AQP1蛋白表達陽性 （×400）

圖13　不同劑量肝素+2.5%葡萄糖對AQP1蛋白表達的影響

3　討論

一直以來，傳統觀點認為腹膜透析中水分子的跨膜轉運方式是簡單擴散，但Agre等[5]發現了28kD通道整合膜蛋白，提出水轉運方式是通過通道蛋白介導的。Rippe等[6]首次運用大孔、小孔、超微孔的3孔模型對水的跨膜轉進行了解釋。超微孔（3～）對水分子具有選擇通透性，水通道蛋白（aquaporins，AQPs）為超微孔的對應物，可選擇性地跨膜轉運水分子及甘油、尿素等某些小分子溶質。水通道蛋白廣泛存在于動植物及微生物的細胞膜上，迄今為止已發現200余種，在哺乳動物中，已克隆并鑒定出13種，分為AQP0～AQP12[7]。

在某些特定條件下，水通道蛋白的表達受到激素、滲透壓改變和某些藥物的影響[8]。Tang等[9]提出AQP1存在于腹膜間皮細胞上，滲透劑葡萄糖可誘導其轉錄和表達。葡萄糖可引起人腹膜細胞形態改變，如微絨毛倒伏、缺失、細胞質內的線粒體出現空泡樣變等[10]。Yang等[11]用氯化汞HgCl2阻斷大鼠腹膜細胞上的AQP1，66%水分子轉運受到抑制。腹膜間皮細胞水通道蛋白AQP1數量、結構或功能的改變對腹膜透析的水超濾有一定影響。陳生曉等[12]認為高糖腹膜透析液可以促進腹膜間皮細胞AQP1的表達。李正紅等[13]認為高糖能增加AQP1從胞質轉移到胞膜上，從而增加該細胞對水的通透性。這種轉移機制的存在提示AQP1在細胞內分布的改變可能也與腹膜超濾衰竭的發生有關。

長期的腹膜透析使腹膜長期暴露在非生理性的高糖透析液中，可引起腹膜組織纖維化以致超濾衰竭，使患者被迫放棄透析治療[14]。臨床上肝素主要用于預防腹膜透析管堵塞。肝素作為抗凝劑能夠通過抑制腹腔內纖維蛋白的聚集而間接減少腹膜纖維化的發生。同時有擴張血管的作用，增加腹膜的通透性，從而增加溶質的濾過。Kar等[15]的研究顯示，高糖誘導的AQP1主要表達在胞漿及胞膜上，胞核亦有少量陽性表達。

本實驗顯示，無葡萄糖無肝素對照組中胞膜及胞漿AQP1表達陽性而胞核陰性，而2.5%葡萄糖組及2.5%葡萄糖+不同劑量肝素組與對照組比較，AQP1表達明顯上調，同時顯示胞核亦有陽性表達，尤以1.5×10-2mg/ml肝素+2.5%葡萄糖組更為明顯（P<0.05），提示肝素和葡萄糖可協同上調腹膜間皮細胞水通道蛋白AQP1的表達。本研究的RT-PCR及免疫組織化學結果一致顯示，與無糖無肝素的對照組比較，2.5%葡萄糖組及2.5%葡萄糖+不同濃度肝素組均能增加AQP1 mRNA和蛋白的表達，差異有統計學意義（P<0.01）；且AQP1 mRNA和蛋白表達水平在2.5%葡萄糖+1.5×10-2mg/ml肝素組呈現明顯上調，差異有統計學意義（P<0.05）。2.5%葡萄糖+1.5×10-2mg/ml肝素組可觀察到人腹膜細胞胞核及胞漿有空泡樣改變。由此推測1.5×10-2mg/ml肝素和2.5%葡萄糖對腹膜透析中腹膜間皮細胞可能存在一定程度的損傷作用，這一損傷的具體過程及分子機制有待深入研究。由此可進一步推測人腹膜間皮細胞中AQP1表達或功能的改變可影響跨腹膜水轉運，甚至可導致腹膜超濾衰竭的發生。

總之，本研究證實在高糖環境下肝素對體外培養的腹膜間皮細胞的AQP1表達有上調作用，在正常劑量下增加其表達但不引起細胞凋亡等空泡樣改變，說明中低劑量的肝素既能增加水通道蛋白AQP1的表達，又可能對人腹膜間皮細胞具有一定程度的保護作用，因此，在腹膜透析時具有較高的安全性，值得臨床廣泛應用及推廣。

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（張蕾編輯）

Impact of different dosages'heparin on the expression of aquaporins 1 of human peritoneal mesothelial cells induced by high concentration glucose

Ge Li1，Jiu-yang Zhao2，Ze-yin Ren1，Wei Xiao1，Yong-feng Gui1
（1.Department of Nephrology，the First People's Hospital，Changde，Hunan 415000，China；2.Department of Nephrology，the Second Hospital Affiliated to Dalian Medical University，Dalian，Liaoning 116000，China）

Objective To investigate the impact of different dosages'heparin on the expression of aquaporin-1 （AQP1）of human peritoneal mesothelial cells（HPMCs）induced by high concentration glucose（2.5%W/W）.Methods HPMCs were separated from patients and sub-cultured，and induced by high concentration glucose for 4，8，12，and 24 h respectively.This is to determinate the time when the mRNA of AQP1 reaches the maximum level.Heparin of different dosages and 2.5%glucose were added into the cell culture medium.The expression levels of AQP1 were detected by using RT-PCR and immunohistochemistry in both control and experimental groups.Results Compared with the control group，the mRNA expression level of AQP1 was up-regulated in an time-dependant manner，with the maximum expression at 24 h induced by high concentration glucose.The protein expression level of AQP1 was also up-regulated in all experimental groups，particularly by 2.5%glucose and 1.5×10-2mg/ml heparin.The difference was of statistical significance（P＜0.05）.The result of RT-PCR is consistent with that of immunohistochemistry.By using immunohistochemistry，vacuolation was observed in the nucleus and cytoplasm treated by 2.5%glu－cose and 1.5×10-2mg/ml heparin.Conclusion The mRNA and protein expression of AQP1 can be up-regulated by 2.5%glucose and heparin.Vacuolation can be observed in the nucleus and cytoplasm treated by glucose and heparin of high concentration.

heparin；human peritoneal mesothelial cells；aquaporin 1

R 572.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.04.004

1005-8982（2016）04-0018-06

2015-11-12