基于細菌16SrRNA基因擴增臨床不常見病原菌的價值

曹敬榮，高世超，陳典典，陳 靜，2，閔 嶸，王培昌（首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院，北京 00053；2江西衛(wèi)生職業(yè)學院，江西南昌 33020）

基于細菌16SrRNA基因擴增臨床不常見病原菌的價值

曹敬榮1，高世超1，陳典典1，陳 靜1，2，閔 嶸1，王培昌1
（1首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院，北京 100053；2江西衛(wèi)生職業(yè)學院，江西南昌 330201）

目的 探討16S rRNA基因擴增與測序在臨床不常見病原菌鑒定中的價值，指導臨床相關(guān)感染的診治。方法 選擇臨床微生物實驗室常規(guī)方法難以準確鑒定、無法鑒定或有特殊表型的細菌12株，采用聚合酶鏈反應（PCR）擴增其16S rRNA基因，測序后進行BLAST比對鑒定菌種，并分析相關(guān)感染的臨床特點。結(jié)果 12株菌經(jīng)PCR擴增均得到陽性條帶（約1 500 bp），均鑒定到種（相似度≥99%），分別為產(chǎn)單核細胞李斯特菌、馬耳他布魯桿菌各2株，死亡梭桿菌、空間羅氏菌、鼻疽奴卡菌、解糖葡萄球菌、放射性根瘤菌、二路普雷沃菌、解甘露醇羅爾斯頓菌及陰道阿托波菌各1株。16S rRNA基因擴增靈敏度高，大腸埃希菌ATCC25922的最低檢測限為1.5× 101CFU/mL。12例患者臨床資料顯示上述菌可引起臨床多部位、多類型感染，選用針對性抗菌藥物治療后11例好轉(zhuǎn)，1例死亡。結(jié)論 16S rRNA基因測序方法可快速、準確鑒定少見菌、厭氧菌及難培養(yǎng)細菌，為臨床不同類型感染的病原學診斷和治療提供實驗室依據(jù)。

16S rRNA；病原菌；鑒定；感染；分子生物方法；聚合酶鏈反應

病原學檢測對感染性疾病的診療十分重要，目前，大部分臨床微生物實驗室采用商品化的鑒定系統(tǒng)鑒定病原菌，但對于臨床少見、疑難或表型相近的細菌，該方法會出現(xiàn)偏差，不能滿足臨床快速、準確鑒定病原菌的需求［1］。隨著分子生物學方法成本逐漸降低、基因數(shù)據(jù)庫不斷更新，基于細菌16S rRNA基因的測序技術(shù)在微生物界已成為熱點［2—5］，并逐漸成為細菌菌種鑒定和分類的金標準［6—8］。本研究選擇實驗室常規(guī)方法難以準確鑒定、無法鑒定或有特殊表型的細菌，應用聚合酶鏈反應（PCR）擴增其16S rRNA基因并測序，探討該方法在臨床不常見病原菌鑒定中的價值。

1　材料與方法

1.1研究資料 選擇臨床微生物實驗室常規(guī)方法難以準確鑒定、無法鑒定或有特殊表型的細菌12株。陽性質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、糞腸球菌ATCC 29212和銅綠假單胞菌ATCC 27853，陰性對照為白假絲酵母菌ATCC10231和雙蒸水。

1.2主要試劑與儀器 主要試劑為Pathogen Lysis Tubes（L）和QIAamp○RUCP Pathogen Mini Kit （QIAGEN，Germany）、Premix Taq和DL2000 DNA Marker（TaKaRa，Japan）、細菌和酵母菌DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）。主要儀器為渦旋振蕩器（Vortex-Genie 2，Scientific In-dustries，USA）、PCR儀（Veriti 9902，Applied Bio-systems，USA）、電泳儀（北京六一儀器廠，中國）、凝膠成像儀（U-Genius，Gene Company，UK）、離心機（（Eppendorf AG22331，Hamburg，Germany）、生物安全柜（Thermo scientific，China）、全自動微生物鑒定儀（Vitek2 Compact，bioMerieux，F(xiàn)rance）、全自動血培養(yǎng)儀（BD BACTEC9120，USA）。

1.3培養(yǎng)及鑒定 需氧菌、兼性厭氧菌采用血平板、中國藍平板，置于5%～10%CO2環(huán)境中進行培養(yǎng)，厭氧菌采用厭氧平板培養(yǎng)；腦脊液、血、關(guān)節(jié)液等培養(yǎng)采用BD公司BACTECTM9240全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)，儀器報陽性后根據(jù)檢驗目的及鏡檢結(jié)果轉(zhuǎn)種血平板、中國藍及巧克力瓊脂平板，35℃培養(yǎng)24～48 h。細菌鑒定時根據(jù)可疑菌落的革蘭染色結(jié)果選擇合適的鑒定卡，利用VITEK2 Compact全自動細菌鑒定系統(tǒng)鑒定。

1.416S rRNA基因PCR擴增

1.4.1DNA提取 實驗菌株和標準菌株DNA的提取按DNA提取試劑盒說明書進行，獲得的DNA模板—20℃保存。

1.4.2PCR擴增 根據(jù)文獻［3］合成細菌通用引物（27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），目的片段約1 500 bp，引物合成和測序委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司。反應體系25μL：Premix EX Taq 12.5μL，Primer上下游各1μL（10μmol/L），DNA模板5μL，雙蒸水補足至25μL。PCR擴增參數(shù)為94℃預變性3 min，94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸1.2 min（35個循環(huán)），最終72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，在紫外凝膠成像系統(tǒng)分析儀中進行觀察。

1.4.3序列分析 PCR產(chǎn)物測序序列提交至Genbank數(shù)據(jù)庫，挑選最佳BLASTN序列比對結(jié)果確定細菌種屬。基因序列的同源性比對與結(jié)果解釋參考美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）MM18-A的判定規(guī)則［9］：相似度≥99%判斷為同種，相似度在95%～99%判斷為同屬，相似度91%～95%則判斷為同科。

1.4.4最低檢出限檢測 大腸埃希菌ATCC 25922培養(yǎng)后制備濃度為0.5麥氏單位的菌液，采用10倍連續(xù)稀釋法，使菌懸液濃度為1.5×108～1.5×101CFU/mL，提取不同濃度菌液DNA并進行PCR擴增，測試PCR擴增陽性所需最低樣本含菌量。

2　結(jié)果

2.116S rRNA通用引物PCR擴增結(jié)果 12株臨床分離少見菌和4株標準菌株（ATCC 25922、ATCC 25923、ATCC 27853和ATCC 29212）經(jīng)PCR擴增，均獲得與目的片段大小一致的基因片段（1 500 bp左右），白假絲酵母菌和雙蒸水PCR擴增結(jié)果均為陰性。見圖1。

圖1　16S rRNA通用引物PCR擴增電泳圖Figure 1 PCR amplification results of 16S rRNA by universal primer

2.216S rRNA基因測序結(jié)果 4株標準菌株的序列結(jié)果在GenBank中比對完全符合（100%）；臨床標本分離的病原菌均鑒定到種水平（相似度≥99%）。病原菌16S rRNA基因序列分析結(jié)果與臨床感染特征見表1。

表1　12株臨床不常見病原菌株的來源、鑒定與臨床感染特征Table 1 Sources，identification，and clinical infectious characteristics of 12 isolates of clinical rare pathogens

2.3PCR檢測大腸埃希菌最低檢測限 大腸埃希菌ATCC 25922的最低檢測限為1.5×101CFU/mL，雙蒸水（陰性對照）基因擴增結(jié)果為陰性。見圖2。

圖2　不同濃度大腸埃希菌PCR擴增電泳圖Figure 2 PCR amplification results of Escherichia coli with different concentrations

2.4臨床感染特征分析 12株少見細菌可引起呼吸道、皮膚軟組織、胸腔、子宮內(nèi)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血流等臨床多部位、多類型感染，具有相應的臨床表現(xiàn)和體征，臨床結(jié)合病原菌鑒定結(jié)果及藥敏結(jié)果選擇針對性的抗菌藥物治療后，11例好轉(zhuǎn)，1例死亡。

3　討論

微生物鑒定及藥敏結(jié)果是指導臨床抗感染治療的重要依據(jù)，準確、快速的病原學鑒定是協(xié)助臨床正確診治患者的前提，目前臨床常規(guī)鑒定方法是根據(jù)細菌的菌落形態(tài)、革蘭染色等進行的表型鑒定（如VITEK2 Compact等商品化微生物鑒定系統(tǒng)），其受多種因素的影響，常出現(xiàn)不能準確鑒定細菌的情況，尤其對臨床少見菌的鑒定率低［1］。16S rRNA存在于所有原核生物中，能鑒定包括罕見菌、苛養(yǎng)菌、厭氧菌等在內(nèi)的所有細菌［2—6］。蔡瑩等［4］通過對臨床84株菌的16S rRNA基因測序發(fā)現(xiàn)，該方法可增加病原體檢測的敏感性和特異性、擴大病原譜、縮短檢測時間、減少抗菌藥物對檢測的抑制作用，相對于常規(guī)方法更準確。本組大腸埃希菌ATCC25922的最低檢測限為1.5×101CFU/mL，可微量檢測病原菌。

本組4株標準菌株16S rRNA基因PCR擴增產(chǎn)物測序，結(jié)果與GenBank中相應菌株比對，符合率100%，且對革蘭陰性菌或革蘭陽性菌均適用，說明16SrRNA序列分析可靠，可用于臨床菌株的鑒定。12株實驗菌株經(jīng)16S rRNA序列分析與比對，均鑒定到種水平（相似度≥99%），說明16S rRNA基因測序方法相較于常規(guī)方法鑒定譜更廣、更準確［1，3］。4號菌VITEK2 Compact鑒定率低（33%的麥氏放線菌、丙酸桿菌和小棒狀桿菌），無法給出準確的鑒定結(jié)果，其原因是系統(tǒng)不包含空間羅氏菌數(shù)據(jù)、且該菌生長緩慢、表型特征易與奴卡菌屬、放線菌屬等混淆所致，但序列測定可準確鑒定；5號菌生長緩慢、菌落不溶于生理鹽水，常規(guī)方法很難鑒定，而16S rRNA序列分析可為臨床確診提供幫助，準確鑒定為鼻疽奴卡菌（99.9%）；6號菌與其他凝固酶陰性葡萄球菌表型特征相似，我國分離率極低，對其研究相對較少［11］，常規(guī)鑒定雖給出結(jié)果但鑒定率低，需16S rRNA等分子學方法進行確認（鑒定率99%）。此外，本組研究還發(fā)現(xiàn)了本實驗室首次鑒定的細菌，如鼻疽奴卡菌和放射性根瘤菌；近年來命名的具有明確臨床意義的細菌，如空間羅氏菌；VITEK2 Compact鑒定率低或鑒定錯誤的細菌，如解糖葡萄球菌、馬耳他布魯桿菌［8］等；以及專性厭氧性細菌，如二路普雷沃菌和陰道阿托波菌［12］。

研究［3—5］發(fā)現(xiàn)，厭氧菌、條件致病菌、少見菌［13］等引起的感染有增加趨勢，給臨床診斷和抗感染治療帶來困難，而基于16S rRNA基因的PCR擴增與測序可提供快速、準確的病原學結(jié)果，幫助臨床醫(yī)生針對性選用抗菌藥物。由于大多苛養(yǎng)菌、厭氧菌不常規(guī)進行藥敏而經(jīng)驗用藥，如無準確的病原菌鑒定將誤導臨床診治，馬耳他布魯桿菌如使用廣譜抗菌藥物治療則臨床無效，改用胞內(nèi)藥物（利福平、多西環(huán)素）后患者很快好轉(zhuǎn)。5號菌的準確鑒定使得臨床確診肺奴卡菌病，并使用敏感的磺胺類藥物，結(jié)合顱腦手術(shù)治療，患者病情得以控制并很快好轉(zhuǎn)。甲硝唑可有效治療厭氧菌感染，而二路普雷沃菌和陰道阿托波菌對甲硝唑天然耐藥，此2例患者更換抗菌藥物（美洛西林/舒巴坦和克林霉素）治療后很快好轉(zhuǎn)。解糖葡萄球菌感染患者死亡，查病例發(fā)現(xiàn)該患者有入住重癥監(jiān)護病房（ICU）、多器官功能衰竭、感染性休克、混合細菌血流感染（解糖葡萄球菌和肺炎克雷伯菌）、年齡大等危險因素，最終導致死亡。產(chǎn)單核細胞李斯特菌是致命的食源性病原體之一，其易引起免疫功能低下或有基礎疾病、老年人等發(fā)生血流感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等，因此對其準確的病原診斷非常重要。

綜上所述，分子診斷在各類細菌感染診斷中具有明顯優(yōu)勢，隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展和基因數(shù)據(jù)庫的不斷完善，基于細菌16S rRNA的測序方法在臨床病原菌鑒定中的應用將越來越廣，但16S rRNA是所有細菌共有，通用引物PCR擴增時一定嚴格控制污染，避免擴增假陽性而誤導臨床。另外，對于混合感染患者直接進行16S rRNA擴增和測序會導致鑒定率低或雙峰，從而影響鑒定，因此16S rRNA的測序方法在非純菌落或混合感染標本的直接檢測中受限；對于種屬間相似性較高（≥99%）的近緣菌，如溶血葡萄球菌等凝固酶陰性葡萄球菌間的鑒定分辨率低，且由于基因突變或基因轉(zhuǎn)移等因素會影響16S rRNA鑒定率［14］，必要時需聯(lián)合gap基因測序提高鑒定準確率［11］。因此，16S rRNA的測序方法應與表型方法，以及相關(guān)試驗方法相結(jié)合，進行綜合分析，以獲得科學、準確的病原學結(jié)果，為臨床診斷和改善感染患者預后提供幫助。

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（本文編輯：豆清婭）

Value of 16SrRNA gene amplification for identification of clinical rare pathogens

CAO Jing-rong1，GAO Shi-chao1，CHEN Dian-dian1，CHEN Jing1，2，MIN Rong1，WANG Pei-chang1（1 Xuanwu Hospital of Capital Medical University，Beijing100053，China；2 Jian-gxi Health Vocational College，Nanchang330201，China）

Objective To evaluate the value of amplification and sequencing of 16S rRNA gene in the identification of clinical rare pathogenic bacteria，and guide the diagnosis and treatment for related clinical infection.Methods 12 bacterial isolates that were difficult，or unable to be identified with conventional laboratory methods，or with special phenotypes were collected.The 16S rRNA gene was amplified by polymerase chain reaction（PCR），then sequenced for identifying bacterial species through BLAST comparison，clinical characteristics of related infection were ana-lyzed.Results 12 clinical isolates were all positive for PCR amplification（about 1 500 bp），species were all identi-fied（similarity≥99%），the identified strains were Listeria monocytogenes（n=2），Brucella melitensis（n=2），F(xiàn)u-sobacterium mortiferum（n=1），Rothia aeria（n=1），Nocardia farcinica（n=1），Staphylococcus saccharolyticus （n=1），Rhizobium radiobacter（n=1），Prevotella bivia（n=1），Ralstonia mannitolilytica（n=1），and Atopobium vaginae（n=1）.The sensitivity of 16S rRNA gene amplification was high，and the minimum detection limit of Escherichia coli ATCC25922 was 1.5×101CFU/mL.Clinical data of 12 patients revealed that these strains can cause multi-sites and multi-types of infection，after patients received targeted antimicrobial therapy，11 improved，and 1 died.Conclusion Sequencing for 16S rRNA gene can rapidly and accurately identify rare，anaerobic，and difficult cultured bacteria，provide laboratory evidence for etiological diagnosis and treatment of different types of infection.

16S rRNA；pathogen；identification；infection；molecular biological method；polymerase chain reaction ［Chin J Infect Control，2016，15（4）：222—226］

R181.3+2

A

1671—9638（2016）04—0222—05

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.04.002

2015—08—22

首都臨床特色應用研究重點專項課題（Z141107002514012）

曹敬榮（1979—），女（漢族），河北省邢臺市人，主治醫(yī)師，主要從事臨床微生物檢驗、細菌耐藥性及分子流行病學研究。

王培昌 E-mail：pcw1905@126.com