二亞硝基哌嗪上調AGR2促進鼻咽癌細胞轉移

王巍巍，唐發清，李躍進

二亞硝基哌嗪上調AGR2促進鼻咽癌細胞轉移

王巍巍，唐發清，李躍進*

（珠海市人民醫院/暨南大學附屬珠海醫院檢驗科，廣東珠海519000）

目的： 探討二亞硝基哌嗪(DNP)通過調控AGR2表達參與鼻咽癌轉移的分子機制。方法：以具有低轉移潛能的鼻咽癌細胞6-10B作為研究材科，應用四甲基噻唑藍(MTT)法檢測DNP對6-10B細胞的非毒性濃度；分別采用間接免疫熒光法、Western blot和實時熒光定量PCR法檢測DNP對6-10B細胞中AGR2蛋白及mRNA表達的影響；采用針對AGR2基因的特異性小干擾RNA(siRNA)沉默6-10B細胞AGR2的表達，并用Transwell小室法檢測其對細胞侵襲和遷移能力的影響。結果：MTT法檢測DNP對6-10B細胞的非毒性濃度為0～10.0 μmol/L；8.0 μmol/L DNP處理6-10B細胞后，間接免疫熒光法檢測發現AGR2蛋白表達明顯上調，且以在細胞質中表達為主；不同濃度的DNP處理6-10B細胞24 h或用8.0 μmol/L的DNP處理6-10B細胞不同時間后，Western blot結果發現AGR2蛋白的表達水平增加且呈濃度和時間依賴性(P＜0.05)；siRNA-AGR2沉默6-10B細胞屮AGR2基因的表達后，DNP誘導6-10B細胞的侵襲及遷移能力較干擾前明顯降低(P＜0.05)。結論：DNP可能通過在轉錄水平上調AGR2的表達，影響鼻咽癌細胞的侵襲和轉移能力。

鼻咽癌；二亞硝基哌嗪；AGR2；腫瘤轉移

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To investigate theinduction of AGR2 expression by dinitrosopiperazine (DNP) in nasopharyngeal cancer cell (NPC) 6-10B and to explore involvement of DNP in NPC metastasis. METHODS：Noncytotoxic concentrations of DNP on 6-10B cells were determined using MTT. Expression of AGR2 protein and mRNA in 6-10B cells which were treated with DNP were detected by indirect immunofluorescence，Western blotting and real-time RT-PCR，respectively. In addition，silencing the expression of AGR2 by siRNA-AGR2 was investigated. The capabilities of invasion and migration of 6-10B cells were investigated using Transwell assay. RESULTS：The range of non-cytotoxic concentrations (NCC) of DNP was 0-10.0 μmol/L. The results of indirect immunofluorescence showed AGR2 mainly expressed in cytoplasm after DNP treatment. These and 5-8F cells had stronger fluorescence intensity than untreated 6-10B cells. The DNP-induced AGR2 expression showed dose- and time-dependent effects. Real-time RT PCR analyses showed that AGR2 mRNA expression rate was 1.01±0.08 in the untreated 6-10B cells and 3.96±0.15 in the cells treated with 8.0 μmol/L DNP. The difference was significant. In addition，the relative fold gene expression of AGR2 in 5-8F cells was higher than that in non-treated 6-10B cells (P＜0.05). The transwell migration and invasion data showed that siRNA-AGR2 transfection blocked AGR2 expression in 6-10B cells. In addition，both DNP-induced invasion and motility were dramatically decreased when AGR2 expression was blocked (P＜0.05). However，DNP could effectively induce cell invasion (P＜0.05) and motility (P＜0.05) when AGR2 was not blocked. CONCLUSION：DNP could up-regulate AGR2 expression in 6-10B cells through transcriptional regulation mechanism and then mediate the metastasis of nasopharyngeal cancer cells.

【KEY WORDS】nasopharyngeal cancer；dinitrosopiperazine；AGR2；neoplasm metastasis

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國南方地域比較常見的惡性腫瘤之一[1]，其發生以南方的廣東、廣西、湖南等地發病率最高，具有顯著的種族和地域分布的特點，是一種與遺傳及環境因素密切相關的疾病[1-2]，但發病機制目前尚未完全明確。早期的流行病學調查和實驗研究發現，鼻咽癌發病的風險與經常食用熏肉、咸魚及腌制食品等飲食習慣有關[3-4]，原因是這些食物的制作方法會增加包括二亞硝基哌嗪(N，N'-Dinitrosopiperazine，DNP)在內的N亞硝胺。 研究證實DNP可誘導鼻咽癌的發生，并對鼻咽細胞具有很高的組織親和性[5]。其不僅參與鼻咽癌的癌變過程[6]，還與鼻咽癌的轉移密切相關[7]。AGR2基因在生物的發育和生長過程中發揮著重要作用[8-9]，具有多種生物學功能，在外界刺激因子的作用下高表達，促進細胞生長和細胞侵襲轉移等。在本課題組前期研究中，通過蛋白組學SILAC 方法比較了DNP處理組細胞和DMSO對照組細胞中的蛋白表達差異，發現在DNP處理組細胞中AGR2顯著高表達。由此推斷DNP可能通過上調AGR2參與鼻咽癌轉移。本研究擬以低轉移性6-10B細胞為細胞模型，用DNP處理后，通過分析DNP對6-10B中AGR2的表達及侵襲和轉移能力的影響，探討DNP參與鼻咽癌轉移的分子機制。

1　材料與方法

1.1主要材料

人鼻咽癌細胞株6-10B和5-8F購自中南大學湘雅中心實驗室細胞庫，為鼻咽癌細胞株SUNE-1的兩個亞株，具有相同的遺傳背景，5-8F具有高成瘤、高轉移的能力，而6-10B則只成瘤、不轉移。DNP由湖南省農業大學化學生物教研室合成，為一環狀亞硝基化合物，分子式為C4H8N4O2。兔抗人AGR2抗體購自Abcam公司。PCR引物，特異性針對AGR2基因的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)及陰性對照siRNA-Mock均由上海生工生物工程有限公司合成并修飾。PCR試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。Transwell小室和化學發光顯色試劑盒購自Corning公司。異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司。反轉錄酶M-MLV購自中山大學達安基因股份有限公司。定量PCR用的SYBR Green PCR Master Mix購自TOYOBO公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養鼻咽癌6-10B和5-8F分別用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養，待細胞貼壁生長后，采用0.2%胰蛋白酶消化后傳代培養1～2 d。

1.2.2MTT法篩選DNP處理6-10B細胞的非毒性濃度將6-10B細胞按每孔2×103個的密度接種至96孔板，37 ℃、CO2體積分數為5%的條件下培養24 h左右，制備細胞板，供MTT實驗使用。將DNP用10%胎牛血清的RPMI-1640培養基分別稀釋至16.0、14.0、12.0、10.0、8.0、6.0、4.0、2.0 μmol/L，分別加在96孔細胞板中，每種濃度設置3個復孔。37 ℃、CO2體積分數為5%的條件下培養24 h，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續培養4 h，終止培養，小心吸去孔內培養液，每孔再加入150 μL DMSO，搖床上低速振蕩10 min左右，待結晶物充分溶解后，酶聯免疫檢測儀測量波長為492 nm處各孔的吸光度值D(492)，參考波長為630 nm。通過檢測活細胞數，計算DNP處理6-10B細胞的非毒性濃度(non-cytotoxic concentration，NCC)。

1.2.3間接免疫熒光法檢測AGR2蛋白的表達及定位

6-10B細胞按每孔1×104個的密度接種于6孔板中，培養24 h，加入DNP(8.0 μmol/L)處理細胞24 h，以未加DNP處理的細胞為空白對照組，未加DNP處理的5-8F為陽性對照組。收集細胞，用預冷的甲醇溶液固定細胞，PBS漂洗細胞3次，加入含5%小牛血清白蛋白的封閉液封閉處理30 min，加入一抗兔抗人AGR2單克隆抗體(1∶100稀釋)，4 ℃反應過夜，用PBS漂洗3次，加入二抗(FITC-羊抗兔IgG，1∶100稀釋)，室溫反應1 h，再加入DAPI染色細胞核，最后在激光共聚焦顯微鏡(×1 000)下觀察AGR2蛋白表達和亞細胞定位的情況。實驗重復3次。

1.2.4Western blot檢測AGR2蛋白的表達收集各組細胞，用試劑盒提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取10 μg蛋白進行SDS-PAGE分離蛋白，并轉移至PVDF膜上，經一抗(AGR2兔抗人單克隆抗體，GAPDH兔抗人單克隆抗體)和二抗(HRP標記的抗兔二抗)反應，最后采用化學發光顯色試劑盒發光顯影。實驗重復3次。

1.2.5實時熒光定量PCR檢測AGR2 mRNA的表達實驗分成3組：DNP(0.0 μmol/L)處理6-10B細胞組；DNP(8.0 μmol/L)處理6-10B細胞組；5-8F細胞對照組。收集各組細胞，采用Trizol試劑提取細胞總RNA，檢測總RNA純度和完整性，按說明書進行操作，取4 μL總RNA，用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，反應體系如下：5×逆轉錄buffer 4.0 μL，dNTPs(10 mmol/L) 0.5 μL，M-MLV(200 U/μL) 1.0 μL，DEPC水 10.0 μL，RNA模板4.0 μL，總體積 20.0 μL。反應條件：37 ℃、1 h，然后95 ℃、3 min。取6 μL cDNA進行實時熒光定量PCR擴增，反應條件：95 ℃、 5 min；95 ℃、15 s，65 ℃、15 s，共40個循環。反應體系：5×buffer 10.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，探針1.0 μL，dNTPs 1.0 μL，Taq酶1.0 μL，補水至總體積50.0 μL，以18 s rRNA作為內參照，采用2-△△CT法計算基因的相對表達量。AGR2基因引物序列：上游5′-GTCAC GTGGCCCAGATTTAT-3′，下游5′-TCTCCTTCTTGGAA GCCTCA-3′。18 s rRNA引物序列：上游5′-CCTGGAT ACCGCAGCTAGGA-3′，下游5′-GCGGCGCAATACGA ATGCCCC-3′。

1.2.6siRNA-AGR2的設計及基因轉染siRNAAGR2和siRNA-Mock由銳博公司合成，每個siRNA序列5 nmol，干擾片段序列如下：Mock，5′-GCTACACA AATCAGCGATTT-3′；siAGR2-1，5′-CUGAUUAGGU UAUGGUUUATT-3′；按Lipofectamine 2000說明書的方法操作，將siRNA-AGR2和siRNA-Mock分別瞬時轉染至6-10B細胞，培養12 h。采用8.0 μmol/L的DNP處理轉染后的細胞，24 h后，Western blot檢測AGR2蛋白的表達情況，分析siRNA對AGR2基因沉默的效率。未用DNP處理組中則加入含0.01%的DMSO培養液進行培養。

1.2.7 細胞侵襲和遷移能力的檢測取轉染后培養至對數生長期的6-10B細胞1×104個，采用8.0 μmol/L的DNP處理細胞24 h后，將細胞加入Boyden-champer(用含基質成分的Matrigel膠包被)上室，下室中則加入含20%胎牛血清的培養液，培養12 h。用棉簽除去未遷移的細胞。甲醇溶液固定細胞后，結晶紫染色。光學顯微鏡下計數細胞。細胞遷移能力的檢測，同樣將1×104個6-10B細胞接種于Boyden-champer(未用含基質成分的Matrigel膠包被)上室，培養12 h，固定并染色細胞，光學顯微鏡下計數細胞。實驗重復3次。

1.3統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析。采用單因素方差分析比較-多組間均數；獨立樣本t檢驗比較兩組間均數。采用x±s表示計量資料，所有檢驗均為雙側檢驗，以α=0.05作為檢驗水準。

2　結果

2.1DNP對6-10B細胞的非毒性濃度

MTT實驗結果見圖1，顯示6-10B細胞在DNP 0～10.0 μmol/L濃度范圍，細胞生長無明顯影響(P＞0.05)，即DNP處理6-10細胞的非毒性濃度為0～10.0 μmol/L。后續實驗從該范圍內選擇DNP的實驗濃度。

2.2DNP對鼻咽癌細胞中AGR2蛋白表達的影響

AGR2使用的二抗為紅色標記的山羊抗兔IgGFITC，細胞核DAPI染色呈藍色。間接免疫熒光法檢測結果見圖2，可見6-10B細胞組、8.0 μmol/L DNP處理6-10B細胞組及5-8F細胞組各組細胞中均有AGR2蛋白的表達，并以在細胞質中表達為主，其中以DNP處理組6-10B細胞中蛋白表達最為顯著。

圖2　DNP對6-10B細胞中AGR2表達的影響

2.3DNP對6-10B細胞AGR2蛋白表達的影響

采用了非毒性濃度的DNP處理6-10B細胞，Western blot檢測6.0、8.0、10.0 μmol/L DNP分別處理6-10B細胞24 h后AGR2的表達水平，以及8.0 μmol/LDNP分別處理6-10B細胞12、18、24 h后AGR2的表達水平。結果顯示，未經DNP處理的6-10B細胞AGR2的表達水平很低，6.0、8.0、10.0 μmol/L不同濃度DNP處理后6-10B細胞AGR2表達水平均高于未處理組，且隨DNP濃度的增大表達逐漸增多(P＜0.05)，表現出一定的濃度依賴性(圖3A、3C)；隨著DNP誘導時間的延長，AGR2的表達逐漸增強，藥物處理24 h組AGR2的表達明顯增強(P＜0.01)，呈現出一定的時間依賴性(圖3B、3D)。AGR2在5-8F細胞組中的表達量明顯高于未經DNP處理的6-10B細胞組。

圖3　非毒性濃度的DNP處理6-10B細胞后AGR2表達的濃度和時間效應

2.4DNP對6-10B細胞中AGR2 mRNA表達的影響

實時熒光定量PCR檢測結果見圖4，可見8.0 μ mol/L的DNP處理6-10B細胞24 h后，AGR2 mRNA的相對表達量明顯高于DNP未處理組(P＜0.05)。

圖4　實時熒光PCR定量法檢測DNP處理后對6-10B細胞中AGR2-mRNA表達的影響

2.5沉默AGR2基因對DNP誘導6-10B細胞轉移的影響

為進一步明確DNP在誘導6-10B細胞侵襲轉移中的作用，沉默AGR2的表達后，實驗分成4組：Mock對照組；DNP(8.0 μmol/L)+Mock組；siRNA-AGR2組；DNP(8.0 μmol/L)+siRNA-AGR2組。培養24 h后，檢測各組AGR2的表達，結果顯示，DNP(8.0 μmol/L)+ siRNA-AGR2組AGR2的表達明顯低于DNP(8.0 μmol/L)+ Mock組(P＜0.05，圖5A、5B)。細胞侵襲和遷移檢測結果顯示，DNP(8.0 μmol/L)+siRNA-AGR2組的侵襲及遷移能力較Mock組均未發生明顯變化，但較DNP (8.0 μmol/L)+Mock組則均明顯降低(P＜0.05，圖5C～F)。說明AGR2蛋內表達下調后，細胞的遷移和侵襲通力都被抑制。提示AGR2可能是DNP作用的靶蛋白之一。

3　討論

NPC是我國南部和東南亞最常見的惡性腫瘤之一，具有較高的侵襲轉移能力。雖然NPC對放療敏感，但5年生存率仍在50%～60%，即使經過正規的治療，還有30%左右III期、IV期的鼻咽癌患者發生遠端器官轉移[10]。一旦頸部淋巴結出現轉移，5年生存率小于50%；而若遠端器官發生轉移，5年生存率則只有20%左右，最常見的遠端轉移部位包括骨(20%)、肺臟(13%)、肝臟(9%)[11]等。因此，挖掘鼻咽癌轉移發生的分子機制，并加以行之有效的干預措施控制其轉移，成為鼻咽癌研究的熱點和重點。

亞硝胺類化合物是鼻咽癌致癌過程中的重要化學致癌物之一，在前期研究工作中，我們將DNP少量多次或短期大量皮下注射，成功地誘導大鼠鼻咽癌[12]。在實驗中發現DNP注射量與大鼠鼻咽癌轉移密切相關，DNP高劑量組大鼠鼻咽癌轉移率明顯增高。臨床檢測還發現鼻咽癌患者血清含有較健康人群高的DNP，且帶頸淋巴結轉移患者DNP量顯著高于無轉移患者。提示DNP不僅與鼻咽癌發生和發展有關，還與鼻咽癌的轉移有相關性[13]。

本課題在對DNP處理6-10B細胞前后蛋白質組差異的研究發現，AGR2蛋白的表達上調[14]。AGR2被發現以來，大量證據表明AGR2在多種人類腫瘤中過量表達，并且與腫瘤的發生和轉移密切相關[15-19]。因此，AGR2可能是DNP誘導鼻咽癌發生且參與轉移的重要靶分子。然而，國內外提及AGR2與鼻咽癌轉移相關的研究未見報道。

圖5　沉默AGR2基因對DNP誘導6-10B細胞侵襲及遷移能力的影響

為探討化學致癌物DNP促進鼻咽癌轉移的分子機制，本研究中采用非毒性濃度的DNP處理低表達AGR2的6-10B細胞，發現DNP能明顯誘導AGR2蛋白表達的上調，并主要表達在細胞質中，濃度為8.0 μmol/L時，其表達量甚至高于其在髙轉移潛能鼻咽癌5-8F細胞中的表達水平，因此提示DNP可有效誘導AGR2蛋白的表達，AGR2蛋白的表達可能與鼻咽癌細胞的惡性程度有關。為進一步探討DNP上調AGR2表達的分子作用機制，我們分析AGR2 mRNA的表達水平，結果表明DNP能誘導AGR2 mRNA表達的上調，提示DNP可能是通過轉錄水平上調蛋白的表達。因此，為進一步明確AGR2在DNP誘導6-10B細胞中的作用，本研究沉默AGR2的達后，發現DNP誘導細胞侵襲和遷移的能力顯著降低，提示DNP誘導鼻咽癌細胞轉移在一定程度上是通過AGR2介導的。

綜上所述，本研究通過分析非毒性濃度的DNP對6-10B細胞中AGR2蛋白水平的影響以及其在誘導6-10B細胞轉移中的作用，推測AGR2蛋白在鼻咽癌轉移中起重要作用，為闡明鼻咽癌高轉移的發病機制提供了一個新的實驗證據和理論基礎。

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Dinitrosopiperazine-mediated up-regulation of AGR2 expression promotes metastasis of nasopharyngeal cancer cells

WANG Weiwei，TANG Faqing，LI Yuejin*
(Department of Clinical Laboratory, Zhuhai People’s Hospital & Zhuhai Hospital of Jinan University, Zhuhai 519000, Guangdong, China)

R73-37

A

1004-616X(2016)02-0115-06

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.007

2015-11-20；

2016-01-20

國家自然科學基金資助項目(81402265)

作者信息： 王巍巍，E-mail：wangweiweicat@163.com。*

，李躍進，E-mail：liyuejincat@163.com