4-硝基喹啉-1-氧化物誘導食管鱗狀細胞癌發生的研究進展

陳欣然，王　玲，王　薇，3，韓利霞，4，劉　莉，5，單保恩，，

4-硝基喹啉-1-氧化物誘導食管鱗狀細胞癌發生的研究進展

陳欣然1，王玲2，王薇1，3，韓利霞1，4，劉莉1，5，單保恩1，2，*

( 1. 河 北醫科大學第四醫院科研中心，河北石家莊050035；2. 河 北醫科大學第四醫院腫瘤研究所免疫室，河北石家莊050035；3. 河北省人民醫院臨床檢驗科，河北石家莊050057；4. 河北省兒童醫院輸血科，河北石家莊050030；5. 白求恩國際和平醫院256臨床部檢驗科，河北石家莊050080 )

食管鱗狀細胞癌(ESCC)是一種常見且預后較差的惡性腫瘤，其發病機制尚未完全明確。建立ESCC模型，研究ESCC發病機制，對于降低ESCC的發病率和病死率具有重要意義。4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)是一種腫瘤誘導劑，已廣泛用于口腔癌的研究，而在ESCC研究中的應用還較少。因此，本文就4NQO體內代謝特點、誘導ESCC模型及誘癌機制的相關文獻進行綜述，以期為食管癌的防治提供一些新的研究線索。

4-硝基喹啉-1-氧化物；食管鱗狀細胞癌；癌前病變；腫瘤誘導劑

目前，食管癌已成為嚴重影響人類生存及生活質量的腫瘤之一，其發病率和病死率分別位居世界惡性腫瘤發病率的第8位和第6位[1]。中國是食管癌的高發國家，發病率和死亡率分別占全球食管癌發病率和死亡率的52.8%和49.3%[2]。食管癌的高發省份為河北、河南、福建和重慶，其次為新疆、江蘇、山西、甘肅和安徽。在河南林州，食管癌和賁門癌發病率最高，占當地所有惡性腫瘤的81.4%[3]。食管癌分為食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌[4]。中國的食管癌高發區95%以上為鱗狀細胞癌，因此建立ESCC模型，研究ESCC的自然進程和發病機制，對于我國食管癌的預防和治療，降低食管癌的發病率和病死率，具有非常重要的意義。

ESCC的誘因很多，主要包括吸煙、飲酒、攝入過量含亞硝酸的食物或水，營養不均衡等。其中，亞硝酸物質攝入過量已成為目前公認的ESCC的主要誘發因素[2]。4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide，4NQO)是一種水溶性喹啉衍生物，能夠通過氧化應激損傷和抑制DNA合成等機制誘導鱗狀細胞癌的產生[5]。前期動物實驗研究表明，4NQO誘導腫瘤的形成具有一定的組織特異性，口服主要誘導口腔及上消化道系統腫瘤的形成，而皮下注射主要誘導肺癌的形成[6-9]。目前對于4NQO誘導口腔癌的研究報道較多，而對ESCC的報道較少。因此，本文主要就4NQO的理化性質、體內代謝特點、誘導ESCC模型及誘癌機制進行簡要綜述。

1　4NQO體內代謝特點及誘癌機制

4NQO為喹啉類衍生物，黃色粉末，易溶于水，為誘癌前體物，進入體內后，通過代謝成有活性的代謝產物發揮誘癌作用，其致癌作用起始于其硝基集團被還原。4NQO被NADH：4NQO硝基還原酶還原成4-羥胺酸喹啉-1-氧化物(4-hydroxyaminoquinoline-1-oxide，4HAQO)和NADPH：苯醌還原酶[10]。帶有4個電子的產物4HAQO是DNA加成物。4HAQO可進一步被乙酰化代謝，并形成DNA加成物。4NQO的代謝產物在DNA的很多位點形成加成物，色譜分析表明有2個鳥嘌呤和1個腺嘌呤加成位點，但體內研究表明4HAQO優先與鳥嘌呤加成。4NQO乙酰化代謝產物的3、4位可分別與鳥嘌呤的N2和C8位結合，與N2結合導致的突變較強而與C8結合導致的突變較弱，這種結合可導致鳥嘌呤被嘧啶代替[11]。4NQO還是UV類似物，可導致龐大的DNA加成物[12]。

4NQO活性代謝產物可通過氧化還原作用產生活性氧如超氧自由基和過氧自由基。氧化還原作用是在酶的催化下，喹啉化合物得到一個電子，繼而再將電子傳遞給一分子的氧，即產生超氧離子或過氧離子[13]。活性氧與細胞內具有氧化還原狀態的信號轉導蛋白結合，將其從還原態氧化成氧化態，從而激活轉錄因子的產生并誘導腫瘤形成。

4NQO誘導的基因毒性和細胞毒性可被多藥耐藥蛋白(multidrug resistance protein，MRP)和硫代轉移酶P1-1(gluthathione S-transferase P，GSTP1-1)逆轉[14]。4NQO是硫代轉移酶P(含GSTP1-1)的作用底物，其結合可被MRP帶出細胞。用放射活性的4NQO分析4NQO-DNA加成物的細胞毒性檢測表明MRP和GSTP1-1可對4NQO加成和細胞毒性產生高水平的保護作用。然而，MRP或GSTP1-1單獨作用對4NQO介導的細胞毒性保護作用很弱。這說明MRP和GSTP1-1在4NQO誘導腫瘤形成的起始和進展過程中起重要的協同保護作用。

4NQO誘導腫瘤形成具有一定的組織特異性，口服攝入其腫瘤發生部位主要集中在舌的背面和腹面，腭部和食管[15-17]，而皮下注射還會影響到肺[18]。4NQO還原酶(硫辛酸氨脫氫酶)通過還原活化4NQO，對4NQO的敏感性起重要作用。食管部位存在大量的硫辛酸氨脫氫酶，因此與其他消化道相比，食管對4NQO的誘導作用更敏感。另外，4NQO還原酶的濃度與口腔黏膜鱗狀細胞癌發病率呈正相關[19]。這些結果表明高4NQO還原酶活性可增加4NQO誘癌的易感性[14]。

4NQO在誘導腫瘤形成模型中具有一定的種屬特異性。4NQO對不同大鼠種系[Dark A gouti ( DA)、Long E vans、S prague D waley (SD)、ACI/MS Fisher 344、Donryu和Wistar/Furth (WF)]作用不同， WF大鼠耐受性較強而DA對4NQO誘導鱗狀細胞癌最敏感[20]。DA和WF雜交大鼠是DA大鼠敏感性的5倍[21]。因此，用4NQO作為致癌誘導劑，其保護或敏感區域基因均可被鑒定。推測這些敏感及耐受基因及其與鱗狀細胞癌的關系對于探索惡性腫瘤的發生機制具有重要的作用。

2　4NQO體外細胞毒性研究

目前尚無4NQO對食管鱗狀細胞的作用研究。Darroudi等[22]發現4NQO可造成中國倉鼠紫外線敏感損傷修復缺陷的CHO細胞和43-3B細胞死亡、染色體異常和姐妹染色單體置換。Bosselaers等[23]報道4NQO可造成中國倉鼠肺V79細胞姐妹染色單體異常。在4NQO對頭頸部細胞的作用研究中，Kim等[24]用mtDNA(線粒體DNA)/nDNA(核DNA)比率反映線粒體損傷修復能力，結果表明，與4NQO未處理組相比，4NQO作用24 h的JHUO19 (舌癌細胞)和JHU-O22(扁桃體淋巴結轉移細胞)細胞mtDNA/nDNA比率分別降低37%和40%，而用于對照的角化細胞系mtDNA/nDNA比率卻有所增加。由以上結果可知，4NQO具有一定的細胞毒性，能夠造成細胞死亡、染色體損傷和染色體損傷修復能力的降低，而4NQO對于食管鱗狀細胞的作用還有待進一步的研究。

3　4NQO體內誘導食管鱗狀細胞癌的研究

如表1所示，在體內實驗中，4NQO可成功誘導食管鱗狀細胞癌的形成。目前用于體內研究的動物主要為小鼠，其中常用的是C57BL/6小鼠，其次為CBA，ICR和L2-D1小鼠。雖然飲水法和涂抹法均可誘導鱗狀細胞癌的形成，但涂抹法僅用于口腔鱗癌的誘導，而飲水法更適用于食管鱗狀細胞癌的研究。一般來說，用于誘導食管鱗狀細胞癌的4NQO濃度為50或100 μg/mL，誘癌時間為16～20周，觀察時間為28周。誘癌過程中，通過HE染色，可清楚觀察到小鼠食管經歷正常、上皮增生、原位癌和浸潤性癌4個病理過程，病變程度與4NQO濃度和誘癌時間均呈顯著正相關。而且，小鼠食管癌形成的病變特點與人食管癌病變形成過程非常相似。綜上可知，4NQO飲水法是體內誘導食管鱗狀細胞癌的良好模型。

表1　4NQO體內誘導食管鱗狀細胞癌實驗的總結

4　4NQO誘導食管鱗狀細胞癌模型的評價

目前用于食管癌的模型主要有自發性動物模型、移植性動物模型、誘發性動物模型和基因工程模型。4NQO誘發的食管鱗狀細胞癌模型較其他類型的模型具有一定的優越性[31]。

自發性動物模型指在自然情況下所發生的食管癌動物模型。該模型完全在自然條件下發生，食管癌的發生、發展過程與人類食管癌相似，主要是反映動物的腫瘤易感性、環境致癌物質和促癌物質的積聚程度。雖然這種模型在理論上較理想，但其存在較大局限性，如發生率低且不穩定，發生時間較難預測且參差不齊，荷瘤動物個體在品系、性別、年齡、腫瘤發生時間、大小等均有較大差異。異種移植模型可以對食管癌組織或者細胞株進行倍增時間、侵襲轉移能力等多種表型特性的鑒定，同時對基因、信號通路等相關機制進行研究，最主要的應用是進行相關抗腫瘤藥物體內實驗。然而，移植瘤模型只是對瘤性組織或具有成瘤性的細胞株的生物學特性進行評估，而無法模擬腫瘤成瘤前的一系列基因突變的累計過程，且不能評估免疫系統在腫瘤進展中的作用，所以，該模型還遠不能滿足闡明腫瘤發生發展的相關機制的要求。誘發性食管癌動物模型為致癌因素與受體動物食管部位直接或間接接觸，使食管部位產生腫瘤的模型。誘發性食管動物模型操作方法簡單，靶器官和誘癌劑恒定，誘發成瘤率高，基本模擬了食管癌變的發生過程，接近人類食管癌的發生發展過程，使人們得以有計劃、有步驟地觀察食管癌變的整個過程，是進行基礎和臨床食管癌研究的常用方法。目前用于誘發性食管癌的誘癌劑主要有甲基芐基亞硝胺(N-nitrosomethylbenzylamine，NMDA)、甲基戊基亞硝胺(methyl-n-amyl nitrosamine/N-Amyl-N-dimethylnitrosamine，MNAN/AMN)和4NQO。然而，NMDA和MNAN/AMN主要用于大鼠食管癌誘導模型，而4NQO可成功誘導小鼠ESCC。基因工程模型可以通過基因敲入/敲出技術構建基因工程動物，進一步明確特定分子事件在食管癌發生發展各階段的空間時序，從而找到關鍵靶標，設計相應靶向治療藥物或者相應的治療策略。然而，目前用于誘導ESCC的基因工程模型主要局限于CyclinD1過表達轉基因小鼠和P53基因突變小鼠，而且兩種基因工程小鼠不能直接發生ESCC。

結合以上食管癌模型的特點可以推斷誘發性食管癌模型和基因工程模型相結合是誘導ESCC的較好組合。利用基因工程小鼠導入或敲除特定基因后，通過4NQO飲水法誘導小鼠食管鱗狀上皮細胞癌及癌前病變，研究靶基因在食管癌形成中的表達變化及在食管癌形成中的作用，既可以較好模擬ESCC的發生過程，又可研究特定基因在食管癌發生發展中的作用，是研究ESCC發病機制及尋找ESCC腫瘤標志物較為理想的模型。

5　 展 望

4NQO作為誘癌劑能夠成功誘導ESCC，對于研究ESCC的發生機制、尋找ESCC及癌前病變的生物標志物，探索ESCC新的治療策略具有重要意義。然而，在4NQO誘導的ESCC研究中，腫瘤標志物的研究還較少，因此，應該利用基因工程小鼠聯合4NQO誘導模型，加強腫瘤標志物的研究，對食管癌及癌前病變的預防和診斷具有重要意義。另外，應加強體外4NQO對食管鱗狀細胞或其相應腫瘤細胞的作用研究，結合體內外實驗結果，深入探討ESCC的發病機制，為ESCC的治療提供新靶點和新思路。

[1] Herszényi L，Tulassay Z. Epidemiology of gastrointestinal and liver tumors[J]. Eur Rev Med Pharmacol S ci，2010，14(4)：249-258.

[2] 吳巖，賀宇彤. 食管癌病因學[J]. 食管外科電子雜志，2014，2(3)：114-120.

[3] 赫捷，邵康. 中國食管癌流行病學現狀，診療現狀及未來對策[J]. 中 國癌癥雜志，2011，21(7)：501-504.

[4] Henry MA，Lerco MM，Ribeiro PW，et al. Epidemiological features of esophageal cancer：Squamous cell carcinoma versus adenocarcinoma[J]. Acta Cir Bras，2014，29(6)：389-393.

[5] Kanojia D，Vaidya MM. 4-nitroquinoline-1-oxide induced experimental oral carcinogenesis[J]. Oral Oncol，2006，42(7)：655-667.

[6] Imaida K，Sato H，Okamiya H，et al. Enhancing effect of high fat diet on 4-nitroquinoline 1-oxide-induced pulmonary tumorigenesis in ICR male mice[J]. Jpn J Cancer Res，1989，80(6)：499-502.

[7] Shrotriya S，Tyagi A，Deep G，et al. Grape seed extract and resveratrol prevent 4-nitroquinoline 1-oxide induced oral tumorigenesis in mice by modulating AMPK activation and associated biological responses[J]. M ol Carcinog， 2015，54(4)：291-300.

[8] Chen Y，Jiang Y，Liao L，et al. Inhibition of 4NQO-induced oral carcinogenesis by dietary oyster shell calcium[J]. Integr Cancer Ther，2015. doi：10.1177/1534735415596572.

[9] Jiang Y，Liao L，Shrestha C，et al. Inhibition of 4-nitroquinoline-1-oxide-induced oral carcinogenesis by dietary calcium[J]. Int J Clin Exp Pathol，2015，8(4)：3529-3542.

[10] Enson AM. Conversion of 4-nitroquinoline-1-oxide(4NQO) to 4-hydroxyamino- quinoline-1-oxide by a dicumarol-resistant hepatic 4NQO introreductase in rats and mice[J]. Biochem Pharmacol，1993，46(7)：1217-1221.

[11] Brüsehafer K，Manshian BB，Doherty AT，et al. The clastogenicity of 4NQO is cell-type dependent and linked to cytotoxicity，length of exposure and p53 proficiency[J]. Mutagenesis，2015. doi：10.1093/ mutage/gev069.

[12] Waters R，Jones CJ，Martin EA，et al. The repair of large DNA adducts in mammalian cells[J]. Mutat Res，1992，273(2)：145-155.

[13] Urvalek AM，Osei-Sarfo K，Tang XH，et al. Identification of ethanol and 4-nitroquinoline-1-oxide induced epigenetic and oxidative stress markers during oral cavity carcinogenesis[J]. Alcohol Clin Exp Res，2015，39(8)：1360-1372.

[14] Morrow CS，Diah S，Smitherman PK，et al. Multidrug resistance protein and glutathione S-transferase P1-1 act in synergy to confer protection from 4-nitroquinoline-1-oxide toxicity[J]. Carcinogenesis，1998，19(1)：109-115.

[15] de Visscher SA，Witjes MJ，vander Vegt B，et al. Localization of liposomal mTHPC formulations within normal epithelium，dysplastic tissue，and carcinoma of oral epithelium in the 4NQO-carcinogenesis rat model[J]. Lasers Surg Med， 2013，45(10)：668-678.

[16] Chu M，Su YX，Wang L，et al. Myeloid-derived suppressor cells contribute to oral cancer progression in 4NQO-treated mice[J]. Oral Dis， 2012，18(1)：67-73.

[17] Yang Z，Guan B，Men T，et al. Comparable molecular alterations in 4-nitroquinoline 1-oxide-induced oral and esophageal cancer in mice and in human esophageal cancer，associated with poor prognosis of patients[J]. In Vivo， 2013，27(4)：473-484.

[18] Nunoshiba T，Demple B. Potent intracellular oxidative stress exerted by the carcinogen 4-nitroquinoline-N-oxide[J]. Cancer Res，1993，53(14)：3250-3252.

[19] Booth DR. A relationship found between intra-oral sites of 4NQO reductase activity and chemical carcinogenesis[J]. Cell Tissue Kinet，1990，23(4)：331-340.

[20] Kitano M，Hatano H，Shisa H. Strain difference of susceptibility to 4-nitroquinoline-1-oxide-induced togue carcinoma in rats[J]. Jpn J Cancer Res，1992，83(8)：843-850.

[21] Tanuma JI，Fujii K，Hiirano M，et al. Five quantitative traint loci affecting 4-nitroquinoline-1-oxide indeced tongue cancer in the rat[J]. Jpn J Cancer Res，2001，92(6)：610-616.

[22] Darroudi F，Natarajan AT，Lohman PH. Cytogenetical characterization of UV-sensitive repair-deficient CHO cell line 43-3B II induction of cell killing，chromosomal aberrations and sister-chromatid exchanges by 4NQO，mono- and bi-functional alkylating agents[J]. Mutat Res，1989，212(2)：103-112.

[23] Bosselaers IE，Caessens PW，Van Boekel MA，et al. Differential effects of milk proteins，BSA and soy protein on 4NQO- or MNNG-induced SCEs in V79 cells[J]. Food Chem Toxicol，1994，32(10)：905-909.

[24] Kim MM，Glazer CA，Mambo E，et al. Head and neck cancer cell lines exhibit differential mitochondrial repair deficiency in response to 4NQO[J]. Oral Oncol，2006，42(2)：201-207.

[25] 陳慧，高鑫，李剛，等. 4NQO誘發C57BL/6小鼠舌癌及食管鱗狀細胞癌模型的建立[J]. 蘇州大學學報：醫學版，2010，30(5)：972-974.

[26] 李晶，于大海，卿海云，等. 4-硝基喹啉-1-氧化物飲水法構建BALB/C小鼠胃癌及食管癌模型[J]. 中華實驗外科雜志，2011，28(9)：1411.

[27] 杜展，王超，張勇，等. C57BL/6小鼠食管鱗狀細胞癌早期病變的形態學改變[J]. 世 界華人消化雜志，2013，21(2)：116-121.

[28] Tang XH，Knudsen B，Bemis D，et al. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice[J]. Clin Cancer Res，2004，10(1)：301-303.

[29] Gunji A，Uemura A，Tsutsumi M，et al. Parp-1 deficiency does not increase the frequency of tumors in the oral cavity and esophagus of ICR/129Sv mice by 4-nitroquinoline 1-oxide，a carcinogen producing bulky adducts[J]. Cancer Lett，2006，241(1)：87-92.

[30] Wilkey JF，Buchberger G，Saucier K，et al. Cyclin D1 overexpression increases susceptibility to 4-nitroquinoline-1-oxide-induced dysplasia and neoplasia in murine squamous oral epithelium[J]. Mol Carcinog，2009，48(9)：853-861.

[31] 黃裔騰，殷秀凱，鐘雪云，等. 食管鱗癌動物模型的研究進展[J].世界華人消化雜志，2011，19(16)：1704-1710.

R735.1

A

1004-616X(2016)02-0151-04

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.015

2015-07-01；

2015-12-03

國家自然科學基金項目(81173611)；河北省重點醫學科研課題(zd2013045)；河北省教育廳學位辦高等學校研究生創新資助項目

作者信息： 陳欣然，E-mail：cxrtht@163.com。*

，單保恩，E-mail：shanbaoen_1962@163.com