Notch3增強三陰性乳腺癌MDAMB-231細胞對順鉑的敏感性

吳華濤，沈家欣，劉　靜，

Notch3增強三陰性乳腺癌MDAMB-231細胞對順鉑的敏感性

吳華濤1，沈家欣2，3，劉靜2，3，*

（1. 汕 頭大學醫學院第一附屬醫院普通外科，廣東汕頭515041；2. 汕 頭大學醫學院長江學者實驗室，廣東汕頭515041；3. 廣 東省乳腺癌診治研究重點實驗室，廣東汕頭515041）

目的： 探討干細胞相關因子Notch3在三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞對順鉑化療敏感性中的作用。方法：用Lipofectamine 2000試劑轉染乳腺癌MDA-MB-231細胞并用G418篩選穩定轉染細胞系，根據轉染質粒不同分為MDA-MB-231-PCLE組(對照組)和MDA-MB-231-N3ICD組(過表達Notch3組)，應用實時熒光定量PCR和Western blot方法檢測不同組間Notch3表達的差異；用CCK8法檢測各組MDA-MB-231細胞對順鉑敏感性的差異；同時利用Lipofectamine 2000轉染Notch3的小干擾序列，根據轉染序列不同分為T47D-NC(對照組)和T47D-siNotch3(Notch3敲減組)；采用免疫印跡檢測Notch3表達改變后凋亡相關因子caspase-3的表達情況。結果：與對照組比較，高表達Notch3后三陰性乳腺癌對順鉑的敏感性增加(P＜0.05)，同時caspase-3的表達隨著Notch3的增加而增加，而在高表達Notch3的乳腺癌T47D細胞中，敲減Notch3的表達使caspase-3表達減少。結論：高表達Notch3可以增加三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞對順鉑的敏感性，從而增強患者化療療效。

Notch3；順鉑；乳腺癌；化療

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To investigate the effect of stem cell-related factor，Notch3 on human triple negativebreast cancer cell，MDA-MB-231 and its resistance to cisplatin，and explore if overexpressed Notch3 can enhance thesensitivity of resistance cells to cisplatin. METHODS：Lipofectamine 2000 was applied to transfect Notch3 plasmid intoMDA-MB-231. These cells were divided into MDA-MB-231-PCLE group and MDA-MB-231-N3ICD group，accordingto the use of different plasmids. RT-PCR and Western blot methods were used to analyze the expression of Notch3 indifferent groups. The effects of cisplatin on cell proliferation were assessed by CCK8 assay and evaluated by GraphPadPrism 5. Lipofectamine 2000 was also applied to transfect the siNotch3 or scramble to cells and they were divided intoT47D-NC and T47D-siNotch3 groups. The protein levels of apoptosis-related factor were detected using RT-PCRmethods and Western blot. RESULTS：Then efficacy of cisplatin to triple negative breast cancer cells was enhanced byoverexpression of Notch3. Apoptosis-related factor，caspase-3 was up-regulated by Notch3 overexpression. However，siNotch3 induced the downregulation of caspase-3 in T47D，in which the expression of Notch3 was high.CONCLUSION：Overexpression of Notch3 enhanced the sensitivity of MDA-MB-231 to cisplatin which suggests thatthis m ay improve the efficiency of chemotherapy in patients with breast cancer.

【KEY WORDS】Notch3；cisplatin；breast cancer；chemotherapy

乳腺癌現已成為女性最常見的惡性腫瘤，占女性惡性腫瘤新發病例的29%[1]。根據腫瘤細胞雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor， PR)和人表皮生長因子受體(human epithelialgrowth factor receptor 2，HER2)表達的不同可將乳腺癌分為不同的分子亞型，其中ER/PR/HER2均為陰性的三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是一種特殊類型的乳腺癌，復發和轉移率高，預后較差。由于缺乏內分泌和抗HER2靶向治療的靶點，TNBC的內科治療以化療為主，但與其他亞型乳腺癌相比，TNBC具有更強的耐藥性。闡明TNBC化療耐藥的分子機制，探索新的治療靶點，及提高耐藥乳腺癌的化療敏感性是現階段研究的熱點。

Notch信號通路是細胞間重要的信號分子之一，與Wnt、Hedgehog等均為干細胞相關因子，不同通路間存在緊密的交聯(crosstalk)，且不同Notch受體的異常調控與多種腫瘤的發生、發展和轉移相關[2]。有研究表明，抑制Notch3的表達可以增強EBV相關鼻咽癌對順鉑的化療敏感性[3]。而在乳腺癌，尤其是TNBC中，順鉑的耐藥機制尚未闡明，因此，本研究主要探討Notch3信號通路對TNBC的調控作用，及對順鉑化療敏感性的影響。

1　材料與方法

1.1細胞株和試劑

人三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231和luminal A型乳腺癌細胞株T47D均購于美國菌種保藏中心(ATCC)。MDA-MB-231及T47D細胞經復蘇后分別在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液中，于37 ℃、CO2體積分數為5%、飽和濕度條件下培養。Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司，順鉑及CCK8檢測試劑購自碧云天生物技術公司。Notch3過表達質粒(PCLE-N3ICD)及對照質粒(PCLE)均為Nicholas Gaiano教授贈送(質粒在Addgene上的編號分別為#26894和#17703，http：//www.addgene.org)[4]。小干擾siNotch3序列(5′-UAUAGG UGUUGACGCCAUCCACGCA-3′)及scramble對照序列(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)均訂購于上海吉瑪公司。Anti-Notch3抗體和anti-caspase-3抗體均購于美國Cell Signaling Technology公司，anti-GAPDH抗體購于上海奇康生物科技有限公司。

1.2質粒轉染及穩定轉染細胞株的篩選

選取常規培養的MDA-MB-231細胞，待其匯合度達到80%～90%時使用Lipofectamine 2000作為轉染試劑，PCLE-N3ICD或PCLE(陰性對照)和pcDNA3.1-luc(G418篩選抗性)以10∶1進行轉染，按照試劑說明書進行操作，在轉染48 h后檢測轉染效率，并加G418進行篩選，待未轉染組細胞全部死亡，即篩選出穩定高表達Notch3的MDA-MB-231細胞株，實驗分組根據轉染質粒不同分為MDA-MB-231-PCLE組(對照組)和MDAMB-231-N3ICD組(過表達Notch3組)，通過實時熒光PCR及Western blot進行驗證Notch3是否高表達。

同樣的方法轉染小干擾序列siNotch3或scramble，建立瞬時敲減細胞株，實驗分組為T47D-NC(對照組)和T47D-siNotch3(Notch3敲減組)。

1.3實時熒光定量PCR檢測MDA-MB-231細胞中Notch3 mRNA的表達水平

待穩定轉染細胞建立完成，分別收集實驗組(MDA-MB-231-N3ICD)和對照組(MDA-MB-231-PCLE)細胞，加入Trizol(TaKaRa)進行裂解并提取RNA，NanoDrop 檢測RNA濃度，使用SYBR?Premix Ex TaqTMII逆轉錄成總cDNA。實時熒光定量PCR使用SYBR?Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)，β-actin作為內參，每個樣品設3個復孔。按2-??CT計算mRNA的相對表達水平。RT-PCR所用引物：Notch3-F，5′-GTGT GTGTCAATGGCTGGAC-3′；Notch3-R，5′-GTGACAC AGGAGGCCAGTCT-3′。β-actin-F，5′-AGCGAGCATC C C C C A A A G T T-3′；β-a c t i n-R，5′-GGGCACGAAGGCTC ATCATT-3′。

1.4Western blot實驗檢測MDA-MB-231細胞中Notch3和caspase-3蛋白的表達水平

同上所述，分別收集實驗組(MDA-MB-231-N3ICD)和對照組(MDA-MB-231-PCLE)細胞，加入RIPA緩沖液進行裂解并提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取30 n g蛋白溶液上樣，SDS-PAGE分離，電泳，轉膜至PVDF后，一抗(Anti-Notch3抗體稀釋比例為1∶3 000，anti-caspase-3抗體稀釋比例為1∶3 000， anti-GAPDH抗體稀釋比例1∶4 000)4 ℃孵育過夜，TBST清洗后，置于二抗(中杉金橋辣根酶標記山羊抗兔/鼠IgG，稀釋比例1∶3 000)中室溫孵育。最后對PVDF膜進行常規曝光成像。

采用同樣的方法收集T47D-NC(對照組)和T47D-siNotch3(Notch3敲減組)中的總蛋白，并檢測Notch3和caspase-3蛋白的表達水平。

1.5CCK8法檢測順鉑對細胞株活性的影響

取對數生長期的穩定轉染細胞株MDA-MB-231-PCLE(陰性對照)和MDA-MB-231-N3ICD細胞，制備成單細胞懸液，以每孔5 000個細胞接種于96孔板，貼壁生長24 h 后，將MDA-MB-231-PCLE(陰性對照)和MDAMB-231-N3ICD細胞分別給予不同劑量的順鉑(0、2.5、5、10、20和40 μ mol/L)處理，置于常規條件下繼續培養48 h 后，每孔加入10 μ L C CK8試劑，2 h 后用酶標儀檢測不同孔的吸光值D(450)，計算細胞生長抑制率。

由于本組實驗中并未達到相應的半數抑制濃度(50% inhibiting concentration，IC50)，采用同樣的方法，再次用高劑量的順鉑(0、1、5、25、125和625 μmol/L)處理MDA-MB-231-PCLE(陰性對照)和MDAMB-231-N3ICD細胞，計算細胞生長抑制率。

1.6生存分析

Notch3信使RNA(mRNA)的表達量與患者預后之間的關系通過Kaplan-Meier Plotter在線數據庫(www. kmplot.com)進行分析，該數據庫涵蓋了3 557例乳腺癌患者的臨床信息，可以在線繪制生存圖，計算危險系數(hazard ratio，HR)和95%可信區間(confidence intervals，CI)。

1.7統計分析用SP IS CS501計9.算0軟使件用，G r計a p量h P資a d料 P r使i sm用 5-x. 0±軟s表件示。，數組據間分析差使異采用t檢驗，α=0.05為檢驗水準。

2　結果

2.1Notch3在穩定轉染細胞株中的表達

熒光定量PCR以及Western blot結果顯示，在穩定轉染MDA-MB-231-N3ICD細胞中Notch3的表達水平明顯高于對照組MDA-MB-231-PCLE細胞(P＜0.05)，見圖1。

2.2Notch3高表達增強MDA-MB-231細胞對順鉑的敏感性

在低濃度梯度順鉑藥物處理組(圖2A)，對照組MDA-MB231-PCLE細胞中最高濃度40 μg/mL仍未使細胞的抑制率達到50%，根據GraphPad Prism 5軟件預測，該組的IC50約為(42.70±1.24) μmol/L。而高表達Notch3 的MDA-MB-231細胞組中，順鉑對MDA-MB-231的抑制作用明顯增加，IC50約為(9.22±1.36) μmol/L，兩組間差異具有統計學意義(P＜0.01)。

由于上述濃度梯度在陰性對照組中未達到50%的抑制率，本研究增加相應的順鉑濃度。如圖2B所示，對照組MDA-MB-231-PCLE細胞中順鉑的IC50約為(68.58±1.15) μmol/L，而高表達Notch3的MDA-MB-231-N3ICD細胞組中，順鉑的抑制作用同樣明顯增加，IC50約為(20.46±1.103) μmol/L，兩組間差異具有統計學意義(P＜0.01)。

圖1　構建高表達Notch3的MDA-MB-231細胞株

圖2　Notch3高表達MDA-MB-231細胞對順鉑敏感性增加

2.3Notch3對MDA-MB-231細胞中caspase-3表達的影響

Caspase-3是細胞凋亡過程中一系列高度調控的半胱氨酸蛋白酶級聯反應的下游蛋白[5]，其可能參與了Notch3對TNBC細胞耐藥機制的調控。為了驗證該假設，本研究檢測了Notch3對MDA-MB-231細胞中caspase-3 的影響。如圖3A所示，轉染Notch3質粒并穩定篩選的乳腺癌細胞中，caspase-3的表達較陰性對照組明顯增加。而在Notch3高表達的T47D細胞中，敲減Notch3的表達，caspase-3的表達也相應減少(圖3B)。

圖3　Notch3對caspase-3表達量的影響

2.4高表達Notch3的乳腺癌患者預后較好

如圖4中所示，高表達Notch3的患者總生存期明顯高于低表達Notch3的患者，危險系數為0.82(0.73～0.92)，提示Notch3在乳腺癌患者中可能起到抑癌基因的作用。

圖4　乳腺癌患者Notch3 mRNA表達與患者的預后相關

3　討論

Notch家族是一類高度保守的跨膜信號蛋白，4個家族成員(Notch1～4)的結構相似，但功能及其在惡性腫瘤中的調控作用則存在廣泛的爭議[6]。其中，Notch3受體在乳腺癌發生發展中的作用存在爭議。Xu等[7]研究了不同Notch受體的mRNA表達水平與乳腺癌患者預后的作用，發現除Notch1高表達導致PR陰性的乳腺癌患者預后較差外，Notch2～4的mRNA表達水平與全部的乳腺癌患者的預后呈正相關關系。而在另一項研究中，利用特異性的抗體OMP-59R5(即Tarextumab)，同時阻滯Notch2和Notch3信號通路，可以降低Notch信號通路下游靶基因的表達并減少腫瘤起始細胞(tumorinitiating cells，TICs)的數量，對各種上皮源性腫瘤具有明顯的治療作用[8]。

另一方面，不同Notch受體的表達對腫瘤化療敏感性的影響也有不同的報道。在前列腺癌中，Notch信號通路與吉西他濱(gemcitabine，GEM)的耐藥密切相關，阻斷Notch信號通路的表達，可以改變前列腺癌細胞的凋亡特性并增加其對GEM的敏感性[9]。Notch信號通路同時也是卵巢癌干細胞的重要分子路徑，以Notch信號通路為靶點的治療方式可以提高卵巢癌細胞的鉑類藥物治療的敏感性，提高療效[10]。而在乳腺癌不同的分子分型中，三陰性乳腺癌因其惡性程度高，復發轉移快，缺少內分泌治療和靶向治療的分子靶點，成為難治性乳腺癌。為了證實Notch3是否在乳腺癌耐藥中有逆轉效果而開展了本項研究。在本項研究中，我們采用了三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231進行研究，在高表達Notch3的細胞株中，Notch3的蛋白水平明顯增加，CCK8結果顯示，順鉑能夠顯著抑制高表達Notch3的MDA-MB-231細胞的增殖，IC50顯著降低。

凋亡抑制是惡性腫瘤的生物學特征之一，也是腫瘤細胞發生耐藥的重要原因[11]。本研究中進一步探討了Notch3增加三陰性乳腺癌細胞對順鉑敏感性的可能機制。Caspase-3是線粒體依賴信號通路和死亡受體信號通路級聯反應所共同的效應酶，其位于級聯反應的下游，是凋亡級聯反應的必經之路[12]。通過Western blot的方法發現，caspase-3的表達隨著Notch3表達量的增加而增加。而在Notch3高表達的非三陰性乳腺癌細胞株T47D中，敲減Notch3的表達，caspase-3表達也相應減少。在乳腺癌細胞中，Notch3可能通過上調caspase-3的活性，增加三陰性乳腺癌細胞的凋亡，提高其對順鉑藥物的敏感性，是Notch3影響三陰性乳腺癌耐藥的重要機制之一。

綜上所述，本研究通過轉染Notch3質粒并穩定篩選，構建了穩定高表達Notch3的三陰性乳腺癌細胞株，能有效逆轉MDA-MB-231對順鉑的耐藥，提高療效，其機制可能是直接或間接增加caspase-3的表達，提高乳腺癌細胞的凋亡水平。

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Overexpression of Notch3 enhance the efficacy of cisplatin to MDA-MB-231

WU Huatao1，SHEN Jiaxin2，3，LIU Jing2，3，*
(1. Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College, Shantou 515041; 2. Changjiang Scholar’s Laboratory, Shantou University Medical College, Shantou 515041; 3. Guangdong Provincial Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Breast Cancer, Shantou 515041, Guangdong, China)

R730.1；R737.9

A

1004-616X(2016)02-0111-05

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.006

2015-10-10；

2015-12-21

國家自然科學基金(81501539)；廣東省自然科學基金(2015A0303 10211)；廣東省創新人才項目(2014KQNCX078)和人才培育項目；汕頭市科技計劃項目(汕府科[2014]62號)

作者信息： 吳華濤，E-mail：wuhuatao@126.com。*

，劉 靜，E-mail：jliu12@stu.edu.cn