酒石酸長春瑞濱脂質微球注射液對荷人乳腺癌裸鼠腫瘤生長的影響

齊雪松，李　寧，王春燕，佟　鵬，茍　巧，鄭　輝

酒石酸長春瑞濱脂質微球注射液對荷人乳腺癌裸鼠腫瘤生長的影響

齊雪松，李寧，王春燕，佟鵬，茍巧，鄭輝*

（中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫學所，中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全應急重點實驗室，北京100088）

目的： 研究酒石酸長春瑞濱脂質微球注射液(NVB-lip)對荷人乳腺癌裸鼠腫瘤生長的影響。方法：35只雌性BALB/c-nu裸鼠，隨機分為NVB-lip高(10 mg/kg)、中(5 mg/kg)、低(2.5 mg/kg)劑量組，陽性對照組(酒石酸長春瑞濱注射液，5 mg/kg)和陰性對照組(脂質化空白溶液)，每組7只。給裸鼠接種人乳腺癌BCAP-37瘤株，待成瘤后，每只動物每次按0.20 mL經尾靜脈注射給藥，間隔3～4 d注射1次，每周注射2次，共注射6次。在第1次注射后第4、7、11、14、18和23天時分別稱小鼠體質量和測量腫瘤體積，計算得出相對腫瘤體積、相對腫瘤增殖率和腫瘤抑制率。結果：與陰性對照組相比，各組荷瘤裸鼠體質量差異均無統計學意義(P均＞0.05)。NVB-lip各劑量組的相對腫瘤體積和相對腫瘤增殖率顯著減小，腫瘤抑制率顯著增大，差異均有統計學意義(P＜0.01)。結論：NVB-lip在2.5～10 mg/kg范圍內抑瘤作用明顯，具有可開發潛力。

酒石酸長春瑞濱脂質微球注射液；裸鼠；人乳腺癌；腫瘤抑制

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To study the effect of vinorelbine tartrate lipid microsphere (NVB-lip) injection on growth of human breast cancer cells in nude mice. METHODS：35 female BALB/c-nu mice were inoculated with human breast cancer BCAP-37 cells. These mice were divided randomly into 5 groups for further treatments：NVB-lip high dose group (NVB-lip 10 mg/kg)，medium dose group (NVB-lip 5 mg/kg)，low dose group (NVB-lip 2.5 mg/kg)，positive drug control group (NVB-free 5 mg/kg) and negative control group (only lipid microsphere). There were 7 mice each group. Injection with NVB-lip was done after 6-8 days when the tumors shaped. NVB-lip was injected intravenously every 3 or 4 days each week for 6 times in total. Weights and tumor volumes(VT) of mice were observed and measured on No. 4，7，11，14，18 and 23 days from the first injection. Relative tumor volumn(VRT) ，relative tumor proliferation rate and tumor inhibition rate were calculated. RESULTS：The weights of nude mice for different groups increased slowly but the differences were not statistically significant. Compared with the negative group，the VRTand relative tumor proliferation rates of NVB-lip groups were reduced but tumor inhibition rate was increased. The differences were statistically significant (P＜0.01). CONCLUSION：The inhibition of NVB-lip high dose group(2.5-10 mg/kg) was more obviously than that of the other groups. NVB-lip may h ave c linical a pplications.

【KEY WORDS】vinorelbine tartrate lipid microsphere injection；nude mice；human breast cancer；tumor inhibition

酒石酸長春瑞濱(vinorelbine tartrate，NVB)是一種新型長春花生物堿類抗腫瘤藥物，具有較強的抗腫瘤活性，是治療轉移或復發性乳腺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、惡性淋巴瘤等有效的化療藥物之一[1-3]。由于該藥在血液、神經、消化和心血管等方面的毒性使其臨床應用受到一定的限制[4-6]。為降低NVB的毒副作用，將其制成脂質微球制劑成為近年來采用的方法。但NVB脂質微球制劑尚在實驗研究階段，其抑瘤效果有待明確。

乳腺癌是女性中發病率較高的腫瘤，且發病呈年輕化趨勢，因而對研發高效、低毒作用的抗癌藥物需求較為迫切。本研究通過荷人乳腺癌裸鼠模型觀察比較酒石酸長春瑞濱脂質微球注射液(vinorelbine tartrate lipid microsphere injection，NVB-lip)抑制腫瘤生長或增殖藥效作用，為NVB新型制劑在乳腺癌治療的臨床應用奠定實驗基礎。

1　材料與方法

1.1實驗動物

BALB/c-nu裸鼠，35只，雌性，由北京大學醫學部實驗動物科學部提供。實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2006-0008；實驗動物使用許可證號：SCXK (京)2006-0025。采用BALB/c-nu裸鼠無菌飼養罩在北京大學醫學部實驗動物科學部常規飼養。

1.2瘤源

人乳腺癌BCAP-37瘤株由中國醫學科學院藥物研究所藥理一室提供。瘤株已分別接種到BALB/c-nu裸鼠并且成瘤。

1.3主要試劑

酒石酸長春瑞濱脂質微球注射液(1 mg/mL)和空白脂質微球注射液(每瓶5 mL)由沈陽藥科大學提供，酒石酸長春瑞濱注射液(10 mg/mL，NVB-free)購自江蘇豪森藥業股份有限公司，無菌注射用水(每瓶10 mL)，購自大通惠達藥業有限公司。所有試劑4 ℃ 密封保存。

1.4實驗方法

1.4.1瘤塊移植接種方法常規消毒裸鼠胸腹部皮膚，在無菌下剝離瘤塊，去除瘤塊中心壞死組織和瘤塊周圍纖維和脂肪組織，將腫瘤組織切割成1.5 mm× 1.5 mm×1.5 mm的腫瘤組織塊。用眼科鑷將2塊腫瘤組織移植到裸鼠右前肢腋窩皮下。

1.4.2荷瘤動物分組和處理移植腫瘤6～8 d后進行隨機分組，稱量各組裸鼠體質量并測量給藥前腫瘤體積(V0)后開始經尾靜脈注射給藥。根據腫瘤生長快慢和動物體質量差異，將35只裸鼠隨機分為5組，每組7只動物。

參照酒石酸長春瑞濱注射液臨床應用方法、推薦劑量和預實驗中小鼠對該受試藥物的最大耐受劑量結果，將受試藥物(NVB-lip)設計為高(10 mg/kg)、中(5 mg/kg)、低(2.5 mg/kg)3個劑量組，分別相當于人體質量有效劑量的13、6.5和3.3倍。另設陽性對照組(NVB-free，5 mg/kg)，相當于人體質量有效劑量的6.5倍；陰性對照組(脂質化空白溶液)。各劑量組受試藥物均用空白脂質化溶液按所需濃度配制，每只動物每次注射體積按0.20 mL經尾靜脈注射給藥，間隔3～4 d注射1次，每周注射2次，共注射6次。

1.4.3荷人乳腺癌瘤株裸鼠腫瘤生長指標的測定荷瘤裸鼠在第1次注射后第4、7、11、14、18和23天時分別用游標卡尺測量腫瘤直徑并稱取裸鼠體質量，于末次給藥后24 h處死動物，稱取體質量，剝離腫瘤塊，稱瘤質量，觀測和比較不同實驗組荷瘤裸鼠給藥后腫瘤生長的差異，并按下列公式計算腫瘤體積(tumor volum， VT) 、相對腫瘤體積(relative tumor volum，VRT) 、相對腫瘤增殖率(relative tumor proliferation rate，T/C)和腫瘤抑制率(tumor inhibition rate，ri)：

其中a、b、c分別表示測量腫瘤的長、寬、高；V為給藥前測量所得腫瘤體積；m-為對照組平均腫瘤質

0-C量，mT為 給藥組平均腫瘤質量。

1.5統計學方法

全部實驗數據均進行方差齊性檢驗，若方差齊性，進行t檢驗；若方差不齊，進行秩和檢驗。應用SAS 9.0統計軟件，檢驗水準為α=0.05。

2　結果

2.1各組荷人乳腺癌瘤株裸鼠給藥期間體質量的變化

見表1。各組荷瘤裸鼠隨給藥時間延長體質量有所增長，但各給藥組體質量變化與陰性對照組比較，差異均無統計學意義(P均＞0.05)。

表1　荷人乳腺癌裸鼠體質量變化(g)

2.2各組荷人乳腺癌裸鼠給藥期間VRT和 相對腫瘤增殖率的變化

由表2可見，隨著給藥時間的延長，各實驗組的相對腫瘤體積VRT均逐漸增大。與陰性對照組比較，差異均具有統計學意義(P＜0.01)，其中NVB-lip高劑量VRT減小趨勢更明顯。與陽性對照組比較，NVB-lip中劑量組VRT未見明顯差異，NVB-lip高劑量組VRT在 給藥后第18天和第23天顯著減小(P＜0.05)，低劑量組VRT在 給藥后第14天增大(P＜0.05)，其余時間點均無顯著差異。以第23天觀察的數據建立NVB-lip劑量效應關系曲線為：y=-2.10x+43.38(校正的決定系數=0.99， P＜0.05)，提示NVB-lip具有明顯抑制人乳腺癌生長或增殖藥效的作用，并在2.5～10 mg/kg范圍內具有劑量效應關系，即隨著NVB-lip劑量的增大VRT減 小。

各給藥組給藥期間移植腫瘤的相對增殖率均可見不同程度的增加，見表3。其中NVB-lip高劑量組增加最少，陽性對照組和NVB-lip中劑量組次之，NVB-lip低劑量組均高于上述各給藥組。NVB-lip中、低劑量組的相對腫瘤增殖率從給藥后第11天達到峰值后呈緩慢下降趨勢(P＜0.05)。

RT

表2　荷人乳腺癌裸鼠相對腫瘤體積(V)的比較

表3　荷人乳腺癌裸鼠相對腫瘤增殖率的比較(%)

2.3 各組荷人乳腺癌裸鼠腫瘤質量和腫瘤生長抑制率的比較

末次給藥后腫瘤質量和腫瘤抑制率變化顯示，各給藥組荷瘤動物平均瘤質量均明顯低于陰性對照組，差異均有統計學意義(P均＜0.01)。各給藥組組間比較，NVB-lip高劑量組瘤質量最小，腫瘤抑制率最高；NVB-lip中劑量組次之；NVB-lip低劑量組與陽性對照接近，且兩者間差異無統計學意義(P＞0.05)。見表4。

表4　荷人乳腺癌裸鼠腫瘤質量和腫瘤抑制率的變化

3　討論

NVB主要作用于腫瘤細胞G2期，屬于細胞周期特異性藥物，它與微管蛋白單體結合，抑制微管的形成，并且具有高度脂溶性，對微管具有解聚作用。正是NVB的這些作用，使腫瘤細胞的分裂增殖停止于有絲分裂中期，從而產生抗腫瘤作用[7]。NVB的抗腫瘤活性十分明顯，但其毒副作用使患者不易堅持使用，成為其在臨床應用中的限制。脂質體包封可以有效的降低NVB的毒副作用，減少藥物在正常組織中的分布，增加藥物在腫瘤組織中的蓄積[8]，且不會改變藥物的主要質量指標[9-10]，但脂質體是否會降低藥物效用始終是臨床工作人員關注的焦點。

本文以荷瘤人乳腺癌裸鼠模型為研究對象，觀察NVB-lip抑制腫瘤生長或增殖藥效的作用。根據各實驗組荷瘤裸鼠相對腫瘤體積、相對腫瘤增殖率、腫瘤質量和腫瘤抑制率指標的變化發現，隨著NVB-lip給藥劑量增加，移植的腫瘤增殖減慢，瘤體發生不同程度的縮小，抑瘤效果明顯。通過給藥后第23天相對腫瘤體積的觀察發現NVB-lip在2.5～10 mg/kg范圍內具有劑量效應關系，抑制腫瘤細胞增殖作用隨給藥劑量增加而增加。末次給藥后各給藥組腫瘤質量和腫瘤抑制率結果顯示，NVB-lip具有明顯抑制腫瘤生長的作用。從NVB-lip 2.5和5 mg/kg劑量組的相對腫瘤增殖率變化還可發現，在連續給藥11 d時達到峰值后呈現緩慢下降的趨勢，這可能與脂質體在體內隨循環時間延長，有助于增加擴散到腫瘤組織中的藥物分布量，進而增加藥效有關[11]，關于NVB-lip在荷瘤小鼠體內的藥代動力學研究也證實了此觀點[12]。NVB-lip低劑量(2.5 mg/kg)組的抑瘤作用與陽性對照(NVB-free)的抑瘤作用效果相當，證實脂質體包封并沒有影響NVB的抑瘤藥效作用，且高劑量(10 mg/kg)抑瘤作用更優。另外，通過對實驗動物的體質量和外觀觀察，并未發現脂質體對機體產生明顯損害或毒性，與Wakelee報道一致[13]。根據上述實驗結果可預測，NVB-lip的抑瘤作用可靠，藥效作用與同劑量陽性對照比較未見明顯變化，故認為NVB-lip具備可開發潛力[14]。本研究未涉及NVB-lip對正常組織器官的影響，后續將進一步深入研究。

[1] 王莉芳，王彩霞，魏娜，等. 酒石酸長春瑞濱脂質體注射液的安全性及抗腫瘤作用研究[J]. 中國藥理學通報，2012，28(11)：1627-1628.

[2] 王鳳岐，陳海霞. 重酒石酸長春瑞濱注射液治療乳腺癌患者的臨床研究[J]. 當 代醫學，2011，17(29)：133-134.

[3] 謝榮盛，陳勇，梁業，等. 重酒石酸長春瑞濱聯合5-氟尿嘧啶二線治療晚期胃癌的臨床觀察[J]. 長江大學學報，2014，11(27)：60-61.

[4] 喬寶紅，宋淑英. 重酒石酸長春瑞濱注射后出現滲漏患者的處理[J]. 陜 西醫藥雜志，2012，41(5)：517.

[5] 王秀云，吳情，凌芳芳. 冰敷預防重酒石酸長春瑞濱引發靜脈炎46例效果觀察[J]. 齊魯護理雜志，2009，15(21)：21.

[6] 陳尚瑜，楊建峰. 重酒石酸長春瑞濱注射液致過敏性休克1例[J]. 醫藥導報，2012，31(9)：1231.

[7] 裴天仙，王晶晶，滕晉瑩，等. 酒石酸長春瑞濱對大鼠免疫和造血系統的長期毒性作用[J]. 中國藥理學與毒理學雜志，2014，28(4)：562-568.

[8] Galano G，Caputo M，Tecce MF，et al. Efficacy and tolerability of vinorelbine in the cancer therapy[J]. Curr Drug Saf，2011，6(3)：185-193.

[9] 王幸平，王志媛，龔偉，等. 酒石酸長春瑞濱成循環熱敏脂質體的荷瘤小鼠藥效學研究[J]. 軍事醫學，2012，36(5)：362-364.

[10] Bahadori F，Topcu G，Eroqiu MS，et al. A new lipid-based nano formulation of vinorelbine[J]. AAPS Pharm Sci Tech，2014，15(5)：1138-1148.

[11] 王棟海，解李麗，張勇，等. PEG2000-DSPE含量不同的酒石酸長春瑞濱脂質體的制備和評價[J]. 中國醫藥工業雜志，2014，45(11)：1046-1049.

[12] 莊翌，陳建偉，徐鑫鑫，等. 長春瑞濱脂質體與長春瑞濱注射液在荷瘤小鼠體內的藥代動力學及組織分布[J]. 中國藥科大學學報，2013，44(3)：253-256.

[13] Wakelee HA，Middleton G，Dunlop D，et al. A phase I pharmacokinetic study of bexarotene with vinorelbine and cisplatin in patients with advanced non-small-cell lung cancer (NSCLC)[J]. Cancer Chemother Pharmacol，2012，69(3)：815-824.

[14] Shi JF，Sun MG，Li XY，et al. A combination of targeted sunitinib liposomes and targeted vinorelbine liposomes for treating invasive breast cancer[J]. J Biomed Nanatechnol，2015，11(9)：1568-1582.

Effect of vinorelbine tartrate lipid microsphere injection on growth of human breast cancer cells in nude mice

QI Xuesong，LI Ning，WANG Chunyan，TONG Peng，GOU Qiao，ZHENG Hui*
(Key Laboratory of Radiological Protection and Nuclear Emergency, National Institute for Radiological Protection, China CDC, Beijing 100088, China)

R730.1

A

1004-616X(2016)02-0103-04

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.004

2015-11-02；

2015-11-26

作者信息： 齊雪松，E-mail：cedar121@sina.com。*

，鄭輝，E-mail：Z henghui@nirp.net