肉桂、丁香、連翹揮發油聯合抑菌作用研究*

黃涵年，闕　斐

(浙江經貿職業技術學院應用工程系，浙江　杭州　310018)

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肉桂、丁香、連翹揮發油聯合抑菌作用研究*

黃涵年，闕斐

(浙江經貿職業技術學院應用工程系，浙江杭州310018)

水蒸氣蒸餾提取肉桂、丁香、連翹三種香辛料揮發油，測定與評價三種揮發油對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑、最低抑菌濃度(MIC)以及揮發油兩兩復配聯用的抑菌活性。結果顯示，供試菌對三種揮發油均高度敏感，且存在劑量效應，隨著揮發油濃度的降低而降低。另外，肉桂(增效2倍)和丁香(增效2倍)、肉桂(增效2倍)和連翹(增效4倍)揮發油復配后對大腸桿菌表現出相加作用，對金黃色葡萄球菌表現出協同作用(均增效4倍)；而丁香和連翹揮發油復配后對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，則表現出無關作用。

肉桂；丁香；連翹；揮發油；抑菌作用

香辛料具有獨特的刺激性香味，廣泛應用于烹飪和食品工業中，起著調香、調味、調色等作用。目前，世界上已知香辛料多達500種。美國香辛料協會(American Spice Association)定義，凡是用來做食品調味用的植物，均可稱為食用香辛植物，我國國家標準《GB/T 12729.1-2008 香辛料和調味品名稱》規定了68種我國常用香辛料植物性產品。另外，香辛料還具有抑菌、抗氧化及多種生理生化作用[1-2]。其中，香辛料的良好抑菌性能已經被諸多研究所證實[3-6]。因此，從香辛料中提取出安全、高效的有效成分作為食品天然抑菌劑，具有廣闊的應用前景。

揮發油(Volatile Oils)，又稱精油(Essential Oils)或者輕油，是一類具有揮發性和芳香氣味、可隨水蒸氣蒸餾出來的非水溶性油狀液體。研究證實，香辛料揮發油有明顯的抑菌活性[7-8]。由于香辛料揮發油作為天然防腐劑具有安全、天然、無毒等特點，符合人們對綠色消費、健康生活的追求，已經成為各國研究者的新寵。目前，可用于香辛料揮發油的提取方法有：蒸餾法、溶劑浸提法、吸收法、水擴散法、冷壓法、冷凍法、超臨界流體萃取法和超聲波萃取法等。

本文選擇肉桂、丁香、連翹三種香辛料，水蒸氣蒸餾提取揮發油，采用濾紙片法、棋盤稀釋法對三種香辛料揮發油、揮發油兩兩混合物聯合的抗菌效應分別進行了研究，以期為香辛料揮發油作為天然防腐劑的研究開發提供理論基礎。

1　實　驗

1.1材料與試劑

肉桂、丁香、連翹購自杭州市江干區藥房；大腸桿菌(Escherichia coli)AS1.90；金黃色葡萄糖球菌(Staphylococcus aureus)AS1.89，均購自中科院微生物所。

營養瓊脂(Nutrient Agar，NA)培養基、營養肉湯(Nutrient Broth，NB)培養基，青島海博生物技術有限公司；吐溫-80(分析純AR)，美國Sigma公司。本實驗所用其余生化試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

水蒸氣蒸餾裝置；恒溫恒濕培養箱(LHS-100CL型)，上海一恒科學儀器有限公司；分析天平(ATL-224-I)，德國艾科勒；壓力蒸汽滅菌鍋(GI54DWS)，廈門致微儀器有限公司；普通生物顯微鏡(N-400M)，寧波永新光學股份有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1水蒸氣蒸餾提取

揮發油與水不相混合，因此，含有揮發油的中草藥可以利用水蒸氣蒸餾法來提取(《中華人民共和國藥典》)。分別將肉桂、丁香、連翹三種香辛料進行粉碎，取200 g粉末于三口圓底燒瓶中，加入10倍量(m/V)的蒸餾水，室溫浸泡2 h，用電熱套加熱直至沸騰，調節溫度，保持料液沸騰狀態提取6 h，待冷凝管上看不到有油滴出現時說明蒸餾徹底。蒸餾提取過程中，注意觀察油水分離器中揮發油提取情況，收集揮發油。

1.3.2揮發油脫水處理

將所得產物裝入分液漏斗，加入適量石油醚搖勻，進行萃取，取上層。用無水硫酸鈉吸收多余水分后，得粗制揮發油。將粗制揮發油轉移至蒸餾燒瓶中，45℃真空旋轉蒸發，待石油醚蒸發徹底后，得精制香辛料揮發油。取出揮發油，用0.22μM的微孔過濾器進行過濾除菌后，置于已滅菌的棕色樣品瓶中，于4℃冰箱中儲存備用。

1.3.3藥液與菌懸液制備

藥液制備。將所得肉桂、丁香、連翹三種揮發油原液，分別用滅菌處理的1.0%吐溫-80蒸餾水溶液依此稀釋配制成100%、80%、60%、40%、20%、10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.313%、0.156%等不同濃度的藥液。

菌懸液制備。分別將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌接種在營養瓊脂上，于37℃培養14 h進行活化，挑取活化的細菌菌落，營養瓊脂劃線培養24 h，用無菌生理鹽水將菌落洗脫下來，充分振蕩，采用平板培養計數法測定細菌數量，再制成106～107CFU/mL的菌懸液，備用。

1.3.4肉桂、丁香、連翹揮發油體外抑菌實驗

采用濾紙片法。用打孔器制備直徑為6 mm圓形濾紙片，滅菌干燥后，分別浸泡于制備的肉桂、丁香、連翹三種揮發油藥液(100%、80%、60%、40%、20%、10%)中1 h，晾干備用。制備滅菌營養瓊脂平皿，吸取已調整濃度的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌懸液0.1mL，加入營養瓊脂平皿。分別取已浸泡三種揮發油的濾紙片貼于平皿上，每皿3片，濾紙片間保持一定的距離。同時以1.0%吐溫-80蒸餾水溶液為陰性對照，以蒸餾水為空白對照。(36±1)℃下培養24 h后，用十字交叉法測抑菌圈大小。實驗重復 3 次。

1.3.5肉桂、丁香、連翹揮發油最低抑菌濃度(MIC)測定

最小抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)是指能抑制細菌生長的最低濃度，常被用來比較不同抑菌物質的抑菌性能，是用來判斷藥物抑菌活性的最重要測定指標[9]。分別取制備的三種揮發油藥液(10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.313%、0.156%、0.078%)2mL加入到無菌平皿，傾入55℃左右滅菌營養瓊脂18mL，充分混勻(培養基中揮發油濃度為1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.0625%、0.0313%、0.0156%、0.0078%)。待培養基凝固后，吸取菌懸液0.1mL于含不同濃度揮發油的培養基上涂布均勻。取2mL 1.0%吐溫-80蒸餾水溶液加入平皿，混勻18mL營養瓊脂，涂布0.1mL為陰性對照，同時設置蒸餾水空白對照。(36±1)℃下培養24 h后，以完全無菌生長的最低精油稀釋濃度為揮發油對某供試菌的最低抑菌濃度(MIC)。實驗重復 3 次。

1.3.6復配聯用揮發油的抑菌活性測定與評價

采用棋盤稀釋法(Checkerboard Method)，兩種供試菌均按照橫排5管+縱裂5管排布，試管內加入9mL培養基。用1.0%吐溫-80蒸餾水溶液分別將A揮發油和B揮發油稀釋成10、5、2.5、1.25、0.625 MIC系列揮發油稀釋液。兩種揮發油不同濃度各0.5mL混勻，并分別按橫排從上至下和縱裂從右往左加入到試管中(圖1)，則試管中兩種揮發油濃度依此為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125MIC。置于(36±1)℃培養24 h。采用測定MIC的方法對各試管內的菌體生長情況進行檢驗。以1.0%吐溫-80蒸餾水溶液為對照。實驗重復3次。

圖1　棋盤稀釋法示意圖

用分級抑制濃度指數(Factional inhibitory concentration indices，FICI)評價兩種揮發油聯合抑菌效果[10-11]，其計算公式為：

FICI=FICA+FICB=(MICA聯合時/MICA單獨時)+(MICB聯合時/MICB單獨時)

FICI的判斷標準為：FICI≤0.5，為協同作用;0.52時為拮抗作用。

1.3.7統計學分析

所有數據都以均值的標準誤(mean±SEM)表示，所有數據分析使用SPSS 17.0計算，圖形由GraphPad Prism 5.0軟件處理。

2　結果與討論

2.1肉桂、丁香、連翹揮發油提取

香辛料植物均含有一定的揮發油，但是不同的香辛料揮發油含量差異較大，顏色也不同，肉桂、丁香、連翹三種揮發油提取結果見表1。

表1　肉桂、丁香、連翹三種揮發油提取結果

其中，肉桂和丁香揮發油均大于1，連翹揮發油密度小于1；丁香揮發油提取得率最高(12.0%～14.0%)，其次為肉桂揮發油提取得率(2.0%～2.5%)，連翹揮發油提取得率最低(1.5%～2.0%)。

香辛料揮發油存在于香辛料植物表皮組織的腺毛、油室、分泌細胞和樹脂道中，多數呈油滴狀存在，也有些與樹脂、粘液質共同存在[12]。使用水蒸氣蒸餾法行香辛料揮發油提取，為了提高得率和提取速度，在提取揮發油前對肉桂、丁香、連翹進行粉碎和浸泡處理后，水蒸氣蒸餾，收集揮發油。三種香辛料揮發油提取過程可以看出，蒸餾初始時揮發油大量餾出，3 h內90%以上的揮發油已經提取出來，3 h后，料液中油類組分減少，油水比降低，共沸點升高，揮發油餾出量減少(圖2)。

圖2　肉桂、丁香、連翹揮發油提取率測定

根據抑菌圈實驗結果判定標準[13]：抑菌圈直徑>15 mm為高度敏感；抑菌圈直徑10～15 mm為中度敏感；抑菌圈直徑為7～9 mm為低度敏感；抑菌圈直徑<7 mm為不敏感；直徑越大抗菌活性越強。結果顯示，三種香辛料揮發油原液及中、高濃度稀釋液(>40%)對供試菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌)均屬于高度敏感。肉桂、丁香、連翹三種揮發油對大腸桿菌的抑菌圈直徑測定結果如圖3所示：肉桂、丁香、連翹揮發油對大腸桿菌生長的抑制能力均隨著濃度的降低而降低，存在劑量效應；各濃度丁香揮發油對大腸桿菌生長的抑菌能力強于肉桂與連翹揮發油抑菌能力。

圖3　肉桂、丁香、連翹揮發油對大腸桿菌的抑菌圈直徑

2.2肉桂、丁香、連翹揮發油抑菌實驗

對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑測定結果如圖4所示：肉桂、丁香、連翹揮發油對金黃色葡萄球菌生長的抑制能力均隨著濃度的降低而降低，存在劑量效應；各濃度肉桂揮發油對金黃色葡萄球菌生長的抑菌能力強于丁香與連翹揮發油抑菌能力。

圖4　肉桂、丁香、連翹揮發油對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑

2.3肉桂、丁香、連翹揮發油最低抑菌濃度(MIC)測定結果

肉桂、丁香、連翹三種揮發油最低抑菌濃度(MIC)測定結果如表2所示。

表2　肉桂、丁香、連翹揮發油對供試菌MIC

由表2可以看出，肉桂揮發油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為0.0625%；丁香揮發油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為0.125%；連翹揮發油對大腸桿菌的MIC為0.125%，對金黃色葡萄球菌的MIC為0.25%。肉桂、丁香、連翹三種揮發油均表現出較強的抑菌作用。

2.4肉桂、丁香、連翹揮發油兩兩復配抑菌活性測定與評價

肉桂、丁香、連翹三種香辛料揮發油兩兩復配后對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進行體外抗菌試驗，聯合抑菌實驗結果見表3。

肉桂揮發油和丁香揮發油復配后對大腸桿菌，MIC聯用值均為MIC單用的0.5倍時，兩者FICI值最小(=1)，因此，肉桂揮發油和丁香揮發油聯合使用后，對大腸桿菌表現出相加作用，增效2倍；對于金黃色葡萄球菌，兩者的MIC聯用值均為MIC單用的0.25倍時，FICI值最小(=0.5)，表現出協同作用，增效4倍。

肉桂揮發油和連翹揮發油復配后對大腸桿菌，MIC肉桂-聯用值為MIC肉桂-單用的0.5倍，MIC連翹-聯用值為MIC連翹-單用的0.25倍時，FICI值最小(=0.75)，表現出相加作用，肉桂揮發油增效2倍，連翹揮發油增效4倍；對于金黃色葡萄球菌，兩者的MIC聯用值均為MIC單用的0.25倍時，FICI值最小(=0.5)，表現出協同作用，均增效4倍。

丁香揮發油和連翹揮發油復配后對大腸桿，MIC丁香-聯用值為MIC丁香-單用的0.125倍，MIC連翹-聯用值與MIC連翹-單用值相等時，FICI值最小(=1.125)，表現出無關作用；對于金黃色葡萄球菌，同樣，當MIC丁香-聯用值為MIC丁香-單用的0.125倍，MIC連翹-聯用值與MIC連翹-單用值相等時，FICI值最小(=1.125)，表現出無關作用。

表3　肉桂、丁香、連翹揮發油聯合抑菌試驗與效果評價

3　結　論

本研究采用水蒸氣蒸餾提取肉桂、丁香、連翹三種揮發油，濾紙片法、棋盤稀釋法測定了三種揮發油單用及兩兩聯用的抑菌作用。結果顯示，(1)肉桂、丁香、連翹三種揮發油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長的抑制能力較強，且存在劑量效應，均隨著濃度的降低而降低；(2)丁香揮發油對大腸桿菌生長的抑菌能力強于肉桂與連翹揮發油，而對于金黃色葡萄球菌，肉桂揮發油的抑菌能力強于丁香與連翹揮發油；(3)肉桂和丁香揮發油復配后對大腸桿菌表現出相加作用，均增效2倍，對金黃色葡萄球菌表現出協同作用，均增效4倍；(4)肉桂和連翹揮發油復配后對大腸桿菌亦表現出相加作用，分別增效2倍與4倍，對金黃色葡萄球菌表現出協同作用增，均增效4倍；(5)丁香和連翹揮發油復配后對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，均表現出無關作用。

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Study on Combined Antiseptic Effects of Cinnamon,Cloves and Forsythia Suspense Volatile Oils*

HUANG Han-nian,QUE Fei

(Department of Applied Engineering,Zhejiang Economic & Trade Polytechnic,Zhejiang Hangzhou 310018,China)

Spices volatile oils of cinnamon,cloves and forsythia suspense were extracted by steam distillation.The inhibition zone diameters,minimum inhibition concentrations (MICs) and the antimicrobial activities of two volatile oils compound on Escherichia coli and Staphylococcus aureus were determined and evaluated.The results showed that the tested microorganisms were highly sensitive to three kinds of volatile oils,all with a dose effect.The antimicrobial activities were decreased with the decrease of concentration of the volatile oils.The combined use of cinnamon (2 times efficiency) and cloves volatile oils (2 times efficiency),cinnamon (2 times efficiency) and forsythia suspense (4 times efficiency) volatile oils both had additive effects on Escherichia coli,and synergic effects on Staphylococcus aureus(all 4 times efficiency),and the combined use of cloves and forsythia suspense volatile oils showed indifferent effects on Escherichia coli and Staphylococcus aureus.

cinnamon; cloves; forsythia suspense; volatile oil; antimicrobial activity

浙江經貿職業技術學院2015年院級科研課題(No:15QN02)。

黃涵年(1988-)，男，助教，主要從事農產品與食品微生物檢驗。

TS201.3

A

1001-9677(2016)011-0095-04