寧夏紫花苜?？傸S酮提取工藝的研究*

陳兵兵，羅桂林，徐龍龍，楊金會

(1 寧夏理工學院文理學院，寧夏　石嘴山　753000；2 寧夏大學 天然氣轉化國家重點實驗室培育基地，寧夏　銀川　750021)

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寧夏紫花苜?？傸S酮提取工藝的研究*

陳兵兵1，羅桂林1，徐龍龍1，楊金會2

(1 寧夏理工學院文理學院，寧夏石嘴山753000；2 寧夏大學 天然氣轉化國家重點實驗室培育基地，寧夏銀川750021)

研究了寧夏石嘴山市鹽堿地種植的紫花苜蓿中總黃酮的提取方法，通過醇提取法對乙醇濃度、提取時間、固液比和提取溫度等進行了單因素實驗及正交實驗；結果發現最佳提取工藝為回流時間6 h、固液比為1:40、乙醇濃度為50%、溫度為70℃，在此條件下紫花苜蓿總黃酮單次提取量為8.7813 mg/g。

紫花苜蓿；總黃酮；提取

苜蓿主要種植在我國青海、新疆、寧夏、甘肅、內蒙古等地，苜蓿中含有多種生物活性成分，黃酮化合物是其主要活性成分之一[1]，這些化合物大部分具有護肝、解毒、抗真菌及抗自由基和抗氧化作用[2-4]。黃酮化合物還具有植物雌激素樣的作用，在畜牧業動物生產上能顯著提高動物生產性能和動物機體抗病力[5-6]。

國內對不同地區和不同產地的紫花苜蓿中總黃酮提取工藝報道的很多，但從寧夏石嘴山市鹽堿地種植的紫花苜蓿中提取總黃酮的研究方面未見報道。本實驗以寧夏石嘴山市大武口區鹽堿地種植的苜蓿為研究對象，通過單因素的影響進行正交實驗，優選出最佳提取工藝條件，為寧夏石嘴山地區苜蓿的進一步開發利用提供理論參考。

1　實　驗

1.1材料

紫花苜蓿采集于寧夏理工學院園林區，于2014年6月采集，經曬烘干、粉碎備用。

1.2儀器及藥品

101-3型電鼓風干燥箱，天津市通利信達科技有限公司；SHB-Ⅲ型循環水式真空泵，陜西太康生物科技有限公司；紫外分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司，DF-101Z集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，山東菏澤祥龍電子科技有限公司；電子天平，上海民橋精密科學儀器有限公司；蘆丁標準品，國藥集團化學試劑有限公司產品。

1.3方法

1.3.1檢測波長的選擇

對照品溶液和樣品溶液在200～700 nm之間進行掃描，發現在380 nm附近有最大吸光度，實驗中選擇測定波長為380 nm。

1.3.2標準曲線的制作

準確稱取已經在100℃下干燥恒重的蘆丁對照品35.7 mg，用30%的乙醇定容到250mL的容量瓶中，再吸取25mL的標準液，用30%的乙醇定容到50mL的容量瓶中，準確移去上述溶液0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL于10mL的容量瓶中，用30%的定容測定吸光度，建立標準曲線，得線性回歸方程為：A=0.0046+20.7918C0，R2=0.99987(圖1)。

圖1　標準曲線圖

2　結果與討論

2.1固液比對總黃酮提取量的影響

準確稱取1.00 g的苜蓿5份，分別用固液比為1:10、1:20、1:30、1:40、1:50的30%的乙醇溶液侵泡24 h，然后在60℃的條件下加熱回流1 h，冷卻后用活性炭脫色24 h后減壓過濾收集濾液，用30%的乙醇溶液定容于100mL容量瓶中，搖勻后取2mL溶液定容于10mL容量瓶，分別測定吸光度，分析固液比對總黃酮提取量的影響。

表1　固液比對總黃酮提取量的影響

2.2乙醇濃度對總黃酮提取量的影響

準確稱取1.00 g的苜蓿6份，以固液比為1:30，分別用濃度為30%、40%、50%、60%、80%和100%的乙醇溶液侵泡24 h，然后在60℃的條件下加熱回流1 h，冷卻后用活性炭脫色24 h后減壓過濾收集濾液，用30%的乙醇溶液定容于50mL 容量瓶中，測定吸光度分析乙醇濃度對總黃酮提取量的影響。

表2　乙醇濃度對總黃酮提取量的影響

2.3溫度對總黃酮提取量的影響

準確稱取1.00 g的苜蓿7份，以固液比為1:30的30%的乙醇溶液浸泡24 h，然后在溫度為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃的條件下加熱回流1 h，冷卻后用活性炭脫色24 h后減壓過濾收集濾液，用30%的乙醇溶液定容于50mL 容量瓶中，測定吸光度分析溫度對總黃酮提取量的影響。

表3　溫度對總黃酮提取量的影響

2.4時間對總黃酮提取的影響

準確稱取1.00 g的苜蓿6份，以固液比為1:30的30%的乙醇溶液浸泡24 h，然后在60℃的條件下加熱回流1 h、2 h、3 h、4 h、5 h和6 h，冷卻后用活性炭脫色24 h后減壓過濾收集濾液，用30%的乙醇溶液定容于50mL容量瓶中，測定吸光度分析時間對總黃酮提取量的影響。

表4　時間對總黃酮提取量的影響

2.5提取次數對總黃酮提取量的影響

準確稱取1.00 g的苜蓿1份，以固液比為1:30的30%的乙醇溶液浸泡24 h，然后在60℃條件下加熱回流1 h，測定總黃酮的含量，殘渣用上述相同的方法重復提取4次，分別測定總黃酮的含量如表5所示。

表5　取次數對總黃酮提取量的影響

2.6正交實驗

由于苜蓿的提取量受到時間、溫度、固液比和濃度4個因素的綜合影響，為了全面研究4個因素對黃酮提取的影響，根據單因素實驗結果，以苜蓿的提取量為考察指標，設計L9(34)正交試驗，正交實驗設計表6，正交實驗結果見表7。

表6　正交實驗設計表

表7　正交實驗結果

經過正交實驗的分析，反應時間、固液比、乙醇濃度和溫度4因素均對苜?？傸S酮的提取量具有極顯著的影響，且4因素的影響主次分別為乙醇濃度>時間>溫度>固液比；從而得出最佳提取工藝為反應時間6 h、固液比為1:40、乙醇濃度為50%、溫度為70℃，在此條件下，紫花苜?？傸S酮提取量為8.7813 mg/g。

2.7穩定性測定

準確稱取1.00 g 備用的苜蓿5份，用固液比為1:40的50%乙醇溶液浸泡24 h，在溫度70℃條件下回流6 h，用活性炭脫色24 h后減壓過濾收集濾液，用50%的乙醇溶液定容于100mL容量瓶中，搖勻后取2mL溶液定容于10mL容量瓶，測量吸光度。

表8　穩定性測定

3　結　論

通過實驗探究，我們已經得到了苜蓿總黃酮提取工藝的最佳條件，即回流時間6 h、固液比為1:40、乙醇濃度為50%、溫度為70℃時苜蓿總黃酮提取量最高量為8.7813 mg/g；若按照提取5次得到總黃酮(5次提取量的總和為15.5589 mg/g)的含量分析，單次總黃酮的最高提取率為56.4%。通過對提取工藝穩定性考察發現，苜?？傸S酮提取總量在8.5501～9.2041 mg/g之間，單次提取率在54.9%～59.2%之間，工藝穩定。

[1]盧成,曾昭海,張濤,等.紫花苜蓿生物活性成分研究進展[J].草業科學,2005,22(9):28-31.

[2]Meragelman T L,Tucker K D,McClord T G,et al.Antifungal flavonoids from Hildegardia barteri [J].J Nat Prod,2005,68:1790-1792.

[3]Rahman M M,Gray A I.Antibacterial and antifungal activities of the constituents of Flemingia paniculata [J].Pharm Biol,2008,46:356-359.

[4]Hirpara K V,Aggarwal P,Mukherjee A J,et al.Quercetin and its derivatives:synthesis,pharmacological uses with special emphasis on antitumor properties and prodrug with enhanced bioavailability [J].Curr Med Chem,2009,9(2):138-161.

[5]謝棒祥,張敏紅,杜榮,等.類黃酮對肉仔雞生產性能及脂質代謝的影響[J].動物營養學報,2002,14(4):49-53.

[6]陶勝宏,韓正康,王國杰.伊普異黃酮對不同生長階段肉雞生長性能和有關血清生化指標的影響[J].畜牧獸醫,2007,39(2):18-21.

Study on Extraction of Flavonoids in Medicago Saliva L from Nningxia*

CHEN Bing-bing1,LUO Gui-lin1,XU Long-long1,YANG Jin-hui2

(1 Wenli College,Ningxi Institute of Science and Technology,Ningxia Shizuishan 753000;2 State Key Laboratory Cultivation Base of Natural Gas Conversion,Ningxia University,Ningxia Yinchuan 750021,China)

The technology for extraction of total flavonoid of Medicago saliva L(alfalfa) plant originated to Saline-alkali from Ningxia was studied.Taking ethanol as extraction,one-factor experiment of ethanol concentration,extraction times,ratio of solid to liquid,and extraction temperature and the orthogonal experiment were studied.The results showed that the optimal extraction technics were as follows:ratio of solid to liquid was at 1:40,extraction time was 6 h,ethanol concentration was at 50%,and extraction temperature was 70℃.Under this condition,the ethanol extracted rate of total flavonoid in alfalfa was 8.7813 mg/g.

Medicago saliva L; total flavonoid; extraction

寧夏理工學院大學生質量工程項目(No.20130502)。

陳兵兵(1987-)，男，助教，主要從事天然產物全合成及有機反應研究。

O69

A

1001-9677(2016)011-0087-03