長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)白血病MOLT-4細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究

董如男

?

長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)白血病MOLT-4細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究

董如男

目的觀察長(zhǎng)春新堿（VCR）對(duì)人急性淋巴細(xì)胞性白血病MOLT-4細(xì)胞促凋亡作用，并探討其作用機(jī)制。方法分別用0、0.01、0.02、0.04、0.08μmol/L長(zhǎng)春新堿處理MOLT-4細(xì)胞，然后用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，用Hochest33258對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，用Rhodam ine123對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，檢測(cè)線粒體膜電位情況。用caspase 8、9、3抑制劑預(yù)處理MOLT-4細(xì)胞，檢測(cè)caspase8、9、3對(duì)細(xì)胞活性的影響。結(jié)果長(zhǎng)春新堿對(duì)細(xì)胞活性具有抑制作用，且呈明確的劑量-效應(yīng)關(guān)系；細(xì)胞核染結(jié)果顯示，長(zhǎng)春新堿可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，劑量越大，凋亡現(xiàn)像越明顯；同時(shí)，長(zhǎng)春新堿可以引起細(xì)胞線粒體膜電位下降，并發(fā)現(xiàn)caspase 9和3參與了細(xì)胞凋亡過(guò)程。結(jié)論長(zhǎng)春新堿可以促進(jìn)MOLT-4細(xì)胞凋亡，作用機(jī)制可能是線粒體膜電位下降，進(jìn)而誘導(dǎo)caspase 9和3活化而促發(fā)細(xì)胞的凋亡。

長(zhǎng)春新堿；凋亡；急性淋巴細(xì)胞性白血病；MOLT-4細(xì)胞

[Abstract]Objective To explore the apoptosis inducing effect of vincristine(VCR)on human acute lymphoblastic leukemia MOLT-4 cells and its mechanisms.Methods MOLT-4 cells were treated with 0,0.01,0.02,0.04,and 0.08μmol/L vincristine, respectively.The cell viabilitywas detected by CCK-8 assay.The nucleiwere stained by Hochest33258,and the cellswere stained by Rhodamine123.The mitochondrial membrane potential was detected.Caspase 8,9,and 3 depressant were used to pretreat MOLT-4 cells,and their effects on cytoactive were detected.Results Vincristine could inhibit the cytoactive and presented definite dose-effect relationship.The nucleistaining indicated that vincristine could promote the apoptosis.The larger the dose was,themore obvious the apoptosis presented.At the same time,vincristine could induce the decrease ofmitochondrialmembrane potential.In addition,itwas discovered caspase 9 and 3 joined the process of apoptosis.Conclusion Vincristine can promote the MOLT-4 cell apoptosis,which may bemediated by mitochondrialmembrane potential decrease that further induce the caspase 9 and 3 activation and cell apoptosis.

[Keywords]vincristine;apoptosis;acute lymphoblastic leukemia;MOLT-4 cell

長(zhǎng)春花原產(chǎn)于地中海、印度和南美洲。而在中國(guó)，其主要在南方種植，如云南、廣東、廣西等地[1]。長(zhǎng)春花是防治癌癥的重要藥物，據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，目前已經(jīng)從長(zhǎng)春花中提取出100多種生物堿[2]。其中活性較高的主要為長(zhǎng)春花堿和長(zhǎng)春新堿[3]。而長(zhǎng)春新堿是從長(zhǎng)春花中提出的很重要的吲哚類生物堿，具有很強(qiáng)的抗癌癥效果，對(duì)于尋求適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行體外抗腫瘤研究具有重要意義[4]。到目前為止，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)春新堿對(duì)宮頸癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等均有一定的抑制生長(zhǎng)及誘導(dǎo)調(diào)亡的作用[5]。急性淋巴細(xì)胞性白血病是由于原始淋巴細(xì)胞及幼稚淋巴細(xì)胞在造血組織異常增殖，并浸潤(rùn)全身各組織臟器的一種造血系統(tǒng)惡性克隆性疾病[6]。兒童與成人均可能發(fā)生，居兒童惡性腫瘤性疾病的首位[7]。因此，尋找一種有效的抗白血病藥物至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)使用長(zhǎng)春新堿來(lái)作用于人急性淋巴細(xì)胞性白血病MOLT-4細(xì)胞，并初步考察其抗腫瘤作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1主要材料長(zhǎng)春新堿購(gòu)買于上海華聯(lián)制藥有限公司(批號(hào):050602A)；Cell counting kit-8(CCK-8)購(gòu)買于日本同仁化學(xué)公司；Z-DEVD-FMK（caspase3抑制劑，氟甲基酮）、Z-IETD-FMK（caspase8抑制劑，氟甲基酮）、Z-LEHD-FMK（caspase 9抑制劑，氟甲基酮)和二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)買于Sigma公司；Hochest33258試劑、Rhodamine123染料購(gòu)買于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2主要儀器酶標(biāo)儀（SpectraMax M5）購(gòu)買于Molecular Devices公司，激光共聚焦掃描顯微鏡（TCS-SP2）德國(guó)leica公司，流式細(xì)胞儀（EPIC.SXL）購(gòu)買于美國(guó)Beckman公司。

1.3細(xì)胞系與細(xì)胞培養(yǎng)MOLT-4細(xì)胞來(lái)自于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于5%CO2、飽和濕度、37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4CCK-8法檢測(cè)長(zhǎng)春新堿對(duì)細(xì)胞活性抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，倒去原來(lái)的培養(yǎng)液，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察；消化完成后，倒掉胰蛋白酶，加入培養(yǎng)液，并將細(xì)胞稀釋成105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種到96孔培養(yǎng)板上，每孔加100μl細(xì)胞懸液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，向96孔培養(yǎng)板上每個(gè)孔中加入不同濃度的長(zhǎng)春新堿，每個(gè)藥物濃度4個(gè)平行孔。置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h。然后棄掉舊培養(yǎng)液，向96孔培養(yǎng)板上每個(gè)孔中加100μl含10%CCK-8的培養(yǎng)液，然后用微量振蕩器振蕩后，用酶標(biāo)儀在450 nm檢測(cè)波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值，計(jì)算抑制率。

2　結(jié)果

2.1長(zhǎng)春新堿對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的作用如表1，CCK-8法測(cè)定結(jié)果顯示，0.01～0.08μmol/L的長(zhǎng)春新堿分別作用MOLT-4細(xì)胞24、48、72 h后，均能抑制細(xì)胞的活性，具有劑量-時(shí)間依賴關(guān)系。經(jīng)過(guò)比較，長(zhǎng)春新堿處理24 h后，細(xì)胞活性抑制效果不明顯；處理72 h，長(zhǎng)春新堿對(duì)細(xì)胞的毒性太強(qiáng)，因此，選擇48 h作為最佳細(xì)胞處理時(shí)間，計(jì)算得IC50值為0.037μmol/L。因此，選擇0.04μmol/L作為中濃度，0.02和0.08μmol/L分別作為低濃度和高濃度。

表1　不同濃度長(zhǎng)春新堿對(duì)M0 L T-4細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用（n＝4）

2.2共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況0.02、0.04、0.08μmol/L低中高3個(gè)濃度長(zhǎng)春新堿分別處理細(xì)胞48 h后，Hochest33258細(xì)胞核染色結(jié)果見圖1。低中高濃度的長(zhǎng)春新堿均能引起細(xì)胞核質(zhì)固縮，并形成凋亡小體。有凋亡小體的細(xì)胞被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞，經(jīng)過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)出細(xì)胞凋亡率。結(jié)果見圖2，低中高濃度長(zhǎng)春新堿引起的細(xì)胞凋亡率分別為（35.6±4.1）%、（56.9±5.2）%、（71.6±3.9）%（P＜0.01）。

2.3長(zhǎng)春新堿對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響經(jīng)過(guò)Rhodamine123染色后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)到低中高濃度的長(zhǎng)春新堿引起的線粒體膜電位下降的百分率分別為（21.3±3.6）%、（36.9±4.1）%、（64.5±2.9）%，不同濃度之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

2.4caspase8、9、3抑制劑對(duì)細(xì)胞活性的影響長(zhǎng)春新堿處理細(xì)胞之前，先用caspase 8、9、3抑制劑預(yù)處理細(xì)胞，然后用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，結(jié)果見表2。caspase 8預(yù)處理組的細(xì)胞活性與同等濃度的長(zhǎng)春新堿處理的細(xì)胞活性無(wú)明顯差異；而caspase 9和3預(yù)處理組的細(xì)胞活性顯著高于同等濃度的長(zhǎng)春新堿處理的細(xì)胞活性（P＜0.05）。

圖2　細(xì)胞凋亡率檢測(cè)與對(duì)照組（0μmol/L長(zhǎng)春新堿）比較，①P＜0.01

3　討論

長(zhǎng)春新堿是夾竹桃科植物長(zhǎng)春花中提取出的生物堿，具有良好的抗腫瘤作用[8]。目前其制劑已被作為臨床抗腫瘤藥物。大量研究表明，長(zhǎng)春新堿可以抑制體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的增殖，并直接殺傷腫瘤細(xì)胞[9]。目前國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，某些抗癌藥物中的一些化學(xué)基團(tuán)可以使分子氧還原形成活性氧（比如O2-等），其可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[10]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平過(guò)高時(shí)，線粒體就會(huì)受到活性氧的氧化攻擊，導(dǎo)致線粒體跨膜電位下降，此外還會(huì)促進(jìn)caspase 9蛋白表達(dá)的上調(diào)，進(jìn)而激活下游的caspase家族蛋白，如caspase 3等，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并產(chǎn)生凋亡小體、引起DNA斷裂等一系列凋亡反應(yīng)[11]。

本課題以MOLT-4細(xì)胞為研究對(duì)象，考察長(zhǎng)春新堿是否也能通過(guò)損壞線粒體這條渠道促使細(xì)胞凋亡。細(xì)胞核染色結(jié)果表明，長(zhǎng)春新堿處理細(xì)胞后，細(xì)胞質(zhì)濃縮，并形成了凋亡小體，這是典型的凋亡現(xiàn)象。Rhodamine123是線粒體膜電位特異性染料，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)春新堿確實(shí)可以引起細(xì)胞線粒體膜電位的下降，并且具有濃度依賴性，證實(shí)了線粒體參與了長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程。

caspase 8為凋亡外源途徑的經(jīng)典促凋亡蛋白，caspase 9為內(nèi)源凋亡途徑的典型促凋亡蛋白，caspase 3為caspase 8和9的下游凋亡執(zhí)行蛋白。本研究通過(guò)caspase 8、9、3的抑制劑來(lái)特異性的抑制caspase 8、9、3，發(fā)現(xiàn)抑制caspase 9和3，都能提高長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率，而caspase 8抑制劑長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡沒(méi)有明顯影響。因此推測(cè)長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的MOLT-4細(xì)胞內(nèi)活性氧水平過(guò)高，導(dǎo)致線粒體跨膜電位下降并促進(jìn)caspase 9蛋白表達(dá)的上調(diào)，然后激活下游的caspase 3，最終促發(fā)了細(xì)胞凋亡。

綜上所述，長(zhǎng)春新堿作為一線的抗癌藥物，對(duì)人白血病T淋巴MOLT-4細(xì)胞具有良好的體外抑制效果，殺死細(xì)胞的方式為凋亡，其可能的機(jī)制為線粒體膜電位下降引起的內(nèi)源性通路介導(dǎo)的凋亡。這為長(zhǎng)春新堿用于人白血病T淋巴癌的治療和研究提供了很好的理論依據(jù)。

表2　caspase8、9、3抑制劑對(duì)細(xì)胞活性的影響（n＝4）

[1]楊瑩瑩,張廣晶,張舒媛,等.長(zhǎng)春花藥理作用研究進(jìn)展[J].西部中醫(yī)藥,2014,10:170-172.

[2]祖元?jiǎng)?羅猛,牟璠松,等.長(zhǎng)春花生物堿成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2006,2:325-329.

[3]董曉寧,趙海福,劉文博.長(zhǎng)春花生物堿提取技術(shù)的研究進(jìn)展[J].畜牧與飼料科學(xué),2012,3:26-28.

[4]Ehrhardt H,Pannert L,Pfeiffer S,et al.Enhanced anti-tumour effects of Vinca alkaloids given separately from cytostatic therapies[J].British Journal of Pharmacology,2013,168(7):1558-1569.

[5]肖春英,梁孝印,付孟莉.長(zhǎng)春新堿臨床研究進(jìn)展[J].社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志,2004,5:33-34.

[6]劉賢明,胡歌,王華慶.長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體介導(dǎo)的腫瘤化療研究現(xiàn)狀[J].醫(yī)學(xué)綜述,2009,3:353-356.

[7]Bader AA,Petru E,Winter R.Long-term follow-up after neoadjuvant chemotherapy for high-risk cervical cancer during pregnancy[J].Gynecologic Oncology,2007,105(1):269-272.

[8]Feng J,Hua F,Bo C,et al.Ability of a specific ERK signal-pathway inhibitor to reverse P-glycoprotein-mediated vincristine resistance in colon cancer cell lines[J].Chinese Journal of Clinical Oncology,2004,1(4):295-300.

[9]Laere SJV,Ueno NT,Pascal F,et al.Uncovering the molecular secrets of inflammatory breast cancer biology:an integrated analysis of three distinct affymetrix gene expression datasets.[J]. Clinical Cancer Research,2013,19(17):4685-4696.

[10]劉玲,王曉桃.急性淋巴細(xì)胞白血病的診斷治療新進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2014,17:3148-3150.

[11]Weng AP,Ferrando AA,Lee W.et al.Activating mutations of NOTCH1 in human T cell acute lymphoblastic leukemia[J]. Science,2004,306(5694):269-271.

Research on apoptosis of leukemia MOLT-4 cells induced by vincristine and itsmechanism

Dong Runan Department of Hematology,Central Hospital ofWeinan City,Weinan,Shaanxi,714000,China

R 733.7

A

1004-0188（2016）03-0278-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.03.017

714000陜西渭南，渭南市中心醫(yī)院血液科

1.5共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將細(xì)胞制成濃度為105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種到共聚焦培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，向培養(yǎng)皿中加入不同濃度的長(zhǎng)春新堿，每個(gè)藥物濃度4個(gè)平行皿。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄掉舊培養(yǎng)液，加入10μM的Hochest33258染液，在培養(yǎng)箱中孵育30 min，然后用PBS清洗細(xì)胞3遍，再用共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞核變化，并統(tǒng)計(jì)不同形態(tài)細(xì)胞核百分率。

1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)長(zhǎng)春新堿對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將細(xì)胞制成濃度為105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種到6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，向培養(yǎng)皿中加入不同濃度的長(zhǎng)春新堿，每個(gè)藥物濃度4個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后用消化液消化細(xì)胞并分散成細(xì)胞懸浮液。用5μM的Rhodamine123避光染色10min，再用2000 r/min離心5min，去掉上清液，再用PBS重懸浮細(xì)胞，并用200目的尼龍篩過(guò)濾細(xì)胞，最后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中Rhodamine123的熒光強(qiáng)度。

1.7caspase抑制劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化細(xì)胞并將細(xì)胞稀釋成濃度為105個(gè)/m l的細(xì)胞懸液，接種到96孔培養(yǎng)板上，每孔加細(xì)胞100μl懸液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，分別加入caspase8、9、3抑制劑預(yù)處理3 h，然后去掉舊培養(yǎng)液加入不同濃度的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。再用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況（×400）
A：對(duì)照組；B：0.02μmol/L長(zhǎng)春新堿組；C：0.04μmol/L長(zhǎng)春新堿組；D：0.08μmol/L長(zhǎng)春新堿組

（2015-12-05）