Wistar大鼠骨髓間充質干細胞的體外培養及成骨誘導實驗

李貴鳳，李　煌，劉　超

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論著

Wistar大鼠骨髓間充質干細胞的體外培養及成骨誘導實驗

李貴鳳，李煌，劉超

目的探討Wistar大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)在體外進行分離、純化以及定向誘導成骨細胞的方法，為進一步利用BMSCs移植治療骨組織缺損奠定基礎。方法體外分離培養BMSCs，并進行定向的成骨誘導分化，采用茜素紅染色、Ⅰ型膠原免疫組織化學染色和免疫組化col-Ⅱ染色等方法進行鑒定。結果經過體外分離培養的大鼠BMSCs在顯微鏡下為貼壁生長的成纖維樣細胞，其形態呈長梭形。經過第一次傳代后的BMSCs形態趨于均一，呈漩渦樣或者菊花樣生長；傳代后在7 d內BMSCs生長迅速，在7 d后細胞密度增加，出現接觸抑制現象，而使細胞的生長速度減慢。經定向誘導后BMSCs明顯表達為成骨表型。結論BMSCs是一種易于在體外分離培養和擴增的細胞群，經體外定向成骨誘導后的BMSCs具有典型的成骨細胞的形態和功能性特征，可以作為骨組織工程的種子細胞。

間充質干細胞；成骨細胞；骨誘導；體外培養；大鼠

[Abstract]Objective To explore the approach to separate and purify Wistar rats'bonemarrow derived mesenchymal stem cells (BMSCs)in vitro and directionally induce osteoblast in order to provide a foundation for further use of BMSCs transplantation to treat bone defect disease.Methods BMSCs from Wistar ratswere isolated and cultured in vitro and directionally induced to osteoblastic differentiation.Identification was made through the methods of alizarin red staining and collagen typeⅠand col-Ⅱimmunohistochemical staining.Results The BMSCs separated and cultured in vitro presented long spindle-shaped fibroblast-like cellswith adherence growth under themicroscope.Themorphology of BMSCs after the first passage tended to be homogeneous with swirl or chrysanthemum like growth.Within 7 days after the passage,BMSCs showed rapid growth.Within 7 days after the passage, the cells grew fast,and the cell density increased after 7 days.Contact inhibition occurred which decreased the cell growth velocity. After the directional induction,BMSCs presented apparent osteogenous phenotype.Conclusion BMSCs can be easily isolated and multiplied in vitro.Those cellswhich were induced to osteoblastic differentiation present typical osteoblastmorphology and functional characteristics.Therefore,BMSCs are the ideal seed cells for the bone tissue engineering research.

[Key words]mesenchymal stem cell;osteoblast;bone induction;culture in vitro;rat

臨床上由于各種因素所致的骨及軟骨損傷、缺失極為常見。如果發生大面積的骨或骨-軟骨的大面積組織缺損，由于它們的自我再生修復能力有限，將會造成器官畸形及功能障礙，從而給患者的生理和心理上造成沉重的負擔[1-2]。而在機體的干細胞群中，有一類重要的細胞被稱為間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，MSCs來源于發育早期的中胚層和外胚層，屬于多能干細胞，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點，而日益受到人們的關注。在不同的條件下，可以誘導成機體不同的組織，而且MSCs在機體的骨髓及其組織器官中，如骨、軟骨、脂肪、內皮、肌肉、神經組織等終生存在，為組織器官修復和更新提供基礎[3]。近年來在組織工程骨-軟骨的構建中，由于骨髓間充質干細胞（BMSCs）的自我復制和不同條件下誘導的多向分化能力，使其成為組織工程中首選的種子細胞[4]。BMSCs可以從脛骨、股骨、髂骨等部位取材，在這些部位取材方便，并且創傷較小，而且易于在體外分離及擴增純化。BMSCs在有核細胞中數量較少，約為0.01%，但其有終生分化為骨或軟骨細胞的能力。本研究經過分離、擴增大鼠BMSCs，并將其在體外誘導向分化為成骨細胞，檢測其成骨活性,為下一步將BMSCs用于骨-軟骨組織工程學的研究打下基礎[5]。

1　材料與方法

1.1材料和儀器

1.1.1實驗材料α-MEM培養基(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，Hepes、ITS、TGF-β1、β-甘油磷酸鈉(SIGMA公司)，兔抗鼠conagen-Ⅱ一抗、SABC免疫組化試劑盒（中衫試劑公司），其他試劑均為國產市售分析純；VS-1300-U型超凈工作臺，Olympus IX70倒置顯微鏡，Nikon TE2000-U倒置顯微鏡，二氧化碳培養箱。

1.1.2實驗動物新生3 d齡Wistar大鼠(南京大學醫學院實驗動物中心提供，動物合格證號2008001652989）24只，體重10 g。

1.2實驗方法

1.2.1Wistar大鼠BMSCs的分離與培養取3 d齡Wistar大鼠，斷頸脫臼處死，置于75%乙醇溶液消毒15 mins。無菌條件下分離出雙側股骨，剪斷股骨干骺端，暴露骨髓腔。以無血清DMEM液沖洗骨髓腔至流出液澄清；收集沖洗液，以1500 r/min離心10min；棄上清，加入DMEM條件培養液(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素及100μg/m l鏈霉素)混懸。調整細胞濃度為5×106/m l，接種于75ml培養瓶，37℃、5%CO2、飽和濕度培養；2 d后半量換液，以后每2～3 d全量換液1次。待細胞達80%以上融合后，0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養。

1.2.2Wistar大鼠BMSCs向成骨細胞誘導取傳代至第3代的BMSCs，消化、清洗后，以DMEM普通培養液調整細胞濃度為1×106/m l，接種于6孔板內，置37℃、5%C02飽和濕度培養箱中培養。待細胞生長達50%融合時，更換為成骨誘導條件培養液（8～10 mol/L地塞米松、100 mg/ml雙抗、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10 mmol/L Vit C，10%血清）誘導培養，每72 h更換液體，每24 h在倒置顯微鏡觀察細胞的變化以及培養液變化。

1.2.3成骨誘導茜素紅染色鑒定成骨誘導2 w后，對細胞爬片進行茜素紅染色：將爬滿細胞的蓋玻片取出，4%多聚甲醛固定20min，在茜素紅染液中染色30min，雙蒸水沖洗，無水酒精脫色，二甲苯透明，封片，倒置顯微鏡下觀察。

1.2.4Ⅰ型膠原免疫組化染色檢測經成骨誘導2 w后，取出6孔板中細胞爬片，PBS液漂洗，4%多聚甲醛固定，PBS漂洗5 min×3次，3%雙氧水中10 min，PBS 5 min×3次，封閉30 min，兔抗一抗4℃孵育過夜；PBS 5 min×3次，羊抗兔二抗37℃30min；PBS 5 min×3次，過氧化物酶標記的鏈球菌親和素三抗37℃、30 min；PBS 5 min×3次，顯色、復染、脫水、封片。

1.2.5Ⅱ型膠原免疫組織化學染色(LSAB法)成軟骨誘導2 w后，對細胞爬片進行Ⅱ型膠原免疫組織化學染色：棄去有細胞爬片的6孔板中的培養基，4%多聚甲醛固定，PBS漂洗5 min×3次，3%雙氧水中10min，PBS 5 min×3次，封閉30 min，兔抗一抗4℃孵育過夜；PBS 5 min×3次，羊抗兔二抗37℃、30min，PBS 5 min×3次，過氧化物酶標記的鏈球菌親和素三抗37℃、30min，PBS 5min×3次，顯色、復染、脫水、封片。

2　結果

2.1BMSCs體外培養原代培養接種24 h后，即可見細胞貼壁生長，貼壁細胞多為短梭形或紡錘形；2～3 d可見細胞集落形成，集落中細胞形態為典型的梭形細胞；7～10 d后細胞進入增殖高峰。經過消化、離心、純化后，貼壁細胞多呈現成纖維細胞樣或多角形狀態；隨細胞生長融合，細胞排列具有方向性，有時呈漩渦狀排列。

2.2BMSCs體外誘導成骨觀察BMSCs經條件培養液誘導培養2 w后，于倒置顯微鏡下觀察可見細胞呈短梭形或多角形，細胞可集落樣生長，集落區可見折光性結節若干，經茜素紅染色呈紫紅色陽性（圖1），Ⅰ型膠原免疫組織化學染色陽性(圖2)。Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色時即可見陽性表達，聚集形成的結節呈強陽性表達，偶可在小結節看到均勻密布的胞膜胞外基質陽性表達(圖3)。

圖1　BMSCs誘導14 d，茜素紅染色陽性(×100)

圖2　BMSCs誘導14 d，Ⅰ型膠原免疫組化染色陽性(SABC×200)

圖3　BMSCs誘導14 d，Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性(SABC×200)

3　討論

BMSCs是一類有多向分化潛能的干細胞，在一定環境和細胞因子的誘導下，可以轉化成機體的各種細胞[6-9]。因其來源不受限，取材方便，對供體損傷小，易于分離培養，體外增殖能力強，且免疫原性低，具有多向分化潛能和良好的遷移性，是目前較為理想的骨組織工程種子細胞的來源。在本實驗中，我們沖洗Wistar大鼠股骨骨髓腔獲得全骨髓細胞，利用不同種類細胞貼壁時間差異篩選BMSCs，并利用消化傳代的反復貼壁法，并輔以DMEM基礎培養液培養，而進一步純化BMSCs。待細胞生長融合后，以成骨條件培養液誘導分化，通過細胞形態學觀察、組織化學染色及免疫組化等方法檢測細胞成骨誘導分化結果。結果發現BMSCs經過誘導2 w后，細胞可呈集落樣生長，集落區域可形成茜素紅染色陽性的礦化結節，而誘導后細胞經Ⅰ型膠原免疫組化染色后呈陽性表達。這些結果表明，骨髓來源的MSCs經純化培養后細胞增殖能力良好，而經過成骨誘導培養后，可以向成骨細胞方向分化，且具有一定的分泌和礦化能力。

本實驗證實了獲取的BMSCs具有多向分化能力，可作為后期實驗復合支架體外成骨與成軟骨的種子細胞[10-15]。

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Culture of rats'bonemarrow derivedmesenchymal stem cells in vitro and ossification induction experiment

Li Guifeng,Li Huang,Liu Chao Departments of Orthodontics,Affiliated Dental Hospital of Medical College,Nanjing University, Nanjing,Jiangsu,210000,China

RQ813.11/681

A

1004-0188（2016）03-0233-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.03.001

國家自然科學基金課題（81470712）

210000南京，南京大學醫學院附屬口腔醫院正畸科

李煌，E-mail：49095530@qq.com

（2015-12-07）