拮抗菌Z-L-22不同劑型對番茄潰瘍病的防治效果

趙　賽,　張維宏,　李建嫄,　楊文香,　張　娜,　劉大群

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系, 河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心,國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心, 保定　071001)

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拮抗菌Z-L-22不同劑型對番茄潰瘍病的防治效果

趙賽,張維宏,李建嫄,楊文香,張娜*,劉大群*

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系, 河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心,國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心, 保定071001)

以對番茄潰瘍病菌拮抗效果良好的西唐鏈霉菌(Streptomycessetonii)菌株Z-L-22為研究對象,開發(fā)出3種大田應(yīng)用劑型——水劑、顆粒劑和片劑,確定了片劑最佳發(fā)酵組分,并測定不同劑型在溫室和棚室對番茄潰瘍病的防治效果。溫室試驗結(jié)果表明,10×發(fā)酵液稀釋液、固體發(fā)酵物5 g和片劑1 g于番茄定植時施用,對番茄潰瘍病防效可達到80%以上;棚室番茄定植75 d后,經(jīng)過水劑、顆粒劑、片劑處理后的番茄發(fā)病率和嚴重度均顯著低于硫酸鏈霉素處理和空白對照。其中片劑由于具有成本低、易儲存運輸、持效期長等優(yōu)點,有很高的開發(fā)價值。

番茄潰瘍病;田間防效;劑型;生物防治

番茄潰瘍病(bacterial canker of tomato)是番茄(LycopersiconesculentumMill.)生產(chǎn)中最為嚴重的細菌病害之一,其病原菌為密執(zhí)安棒狀桿菌密執(zhí)安亞種(Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis)。近年來該病在我國每年均有不同程度發(fā)生,且呈逐年擴散和加重的趨勢。2011年河北省望都縣植保站對全縣番茄大棚進行了系統(tǒng)調(diào)查,發(fā)現(xiàn)番茄潰瘍病病棚率達75%以上,給番茄種植戶造成嚴重的經(jīng)濟損失。目前大田應(yīng)用的防治措施主要是浸種消毒,發(fā)病初期使用化學(xué)藥劑如50%琥膠肥酸銅(DT)、14%絡(luò)氨酮、農(nóng)用鏈霉素等對植株地上部分噴藥或?qū)Φ叵赂抗嗨嶽12],但其防治效果極其有限,且污染環(huán)境,易使病原菌產(chǎn)生抗藥性。

西唐鏈霉菌Z-L-22是從番茄根圍土壤中分離得到的一株對番茄潰瘍病菌具有很高拮抗活性的生防菌株[3]。本試驗以該菌株為研究對象,探索其發(fā)酵最佳營養(yǎng)配比,在此基礎(chǔ)上開發(fā)出了3種應(yīng)用劑型——水劑(發(fā)酵液)、顆粒劑和片劑,并在溫室和田間檢測其對番茄潰瘍病的防治效果,為開發(fā)出適宜推廣應(yīng)用的番茄潰瘍病防治手段奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

Z-L-22生防菌株由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物防治研究中心分離并保存。供試番茄品種為‘惠麗’(溫室)、‘百利’和‘齊達利’(大田)。

1.2主要培養(yǎng)基及儀器

高氏一號培養(yǎng)基:可溶性淀粉20 g,KNO31 g,K2HPO40.5 g,MgSO4· 7H2O 0.5 g,NaCl 0.5 g,FeSO4· 7H2O 0.01 g,瓊脂20 g,H2O 1 000 mL。用于Z-L-22菌株培養(yǎng)和保存。

黃豆浸汁培養(yǎng)基:黃豆餅粉10 g,葡萄糖10 g,蛋白胨3 g,NaCl 2.5 g,CaCO32 g,H2O 1 000 mL。用于Z-L-22菌株發(fā)酵培養(yǎng)。

LRH-250A生化培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠);VS-1300L-U潔凈工作臺(蘇凈集團安泰公司);HZQ系列恒溫振蕩器(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司);HVE-50立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋(HIRAWAMA生產(chǎn)公司);GUJ-S500型發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司)。

1.3生防制劑的制備

Z-L-22大體積發(fā)酵液的制備:根據(jù)張維宏[4]對Z-L-22液體發(fā)酵培養(yǎng)基的研究,選定葡萄糖作為碳源,黃豆餅粉作為氮源。用新鮮的Z-L-22菌種制備孢子懸浮液,調(diào)整孢子濃度為108cfu/mL,以1%的接種量接種于250 mL(pH 7.0)的黃豆浸汁發(fā)酵培養(yǎng)基中,在(28±2)℃下,200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。然后以10%的量分別依次接種到20 L和500 L發(fā)酵罐。

顆粒劑制備:按1 L發(fā)酵液與0.5 kg玉米芯顆粒的比例充分混合后,28℃培養(yǎng)3 d,讓拮抗菌充分附著在固體顆粒上,28℃陰干,制成生防菌固體顆粒劑[5]。

片劑的制備:以液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分為基礎(chǔ),采用雙因素方差分析法[6]進行碳、氮源比例(10%,15%,20%,25%)優(yōu)化,種子液接種后培養(yǎng),檢測菌含量[7],每個處理設(shè)3個重復(fù)。在最佳營養(yǎng)成分配比條件下培養(yǎng)拮抗菌,28℃烘干、制粒,最終壓片成型。

菌含量穩(wěn)定性測定:將顆粒劑和片劑樣本分別置于4℃和28℃下保存,稀釋平板法測定0、15、30、45、90、120 d后的菌含量。

1.4生防制劑溫室防效試驗

番茄2～3片真葉期定植時分別設(shè)置以下處理:水劑(發(fā)酵液)原液、5×、10×、20×稀釋液100 mL澆灌,發(fā)酵固體1、5、10、20 g,片劑0.5、1、1.5、2 g分別穴施,以0.3 g/L硫酸鏈霉素處理為藥劑對照,清水處理為空白對照。每處理20株,設(shè)3次重復(fù)。隨即采用針刺法結(jié)合打頂法[8]統(tǒng)一接種幼苗,處理20 d后調(diào)查,計算病情指數(shù)和防效,并用SPSS軟件進行方差分析。病情指數(shù)和防效鑒定和計算方法如下:

病株率(%)=病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100;

病情指數(shù)=[∑(病級數(shù)值×病級株數(shù))]/(病級最高值×調(diào)查株數(shù))×100;

防治效果(%)= (對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100。

1.5生防制劑田間防效試驗

1.5.1田間試驗設(shè)計

田間試驗在河北省望都縣紅果實蔬菜基地多年種植番茄、病情相對嚴重的地塊進行。試驗設(shè)置5個處理:處理1為10×稀釋發(fā)酵液100 mL灌根,處理2為顆粒劑5 g/株穴施,處理3為片劑1 g/株穴施,處理4為清水處理(空白對照),處理5為0.3 g/L硫酸鏈霉素(藥劑對照)。各處理3次重復(fù),均為定植同時施用(藥品用量根據(jù)前期溫室試驗確定)。

1.5.2土壤中鏈霉菌Z-L-22增殖情況檢測

在番茄定植后30、45、60、75 d,采集番茄根圍土壤,稀釋平板法將土壤懸浮液涂于加有0.06 g/L重鉻酸鉀和0.2 g/L青霉素的高氏一號培養(yǎng)基[9]上培養(yǎng)5 d,通過抗藥性標記,并結(jié)合菌落形態(tài),確定Z-L-22在土壤中的定殖量。

1.5.3病害調(diào)查及統(tǒng)計

分別在45(對照處理中出現(xiàn)發(fā)病植株)、75、105 d對處理番茄植株進行潰瘍病調(diào)查。計算病情指數(shù)和防效,并用SPSS軟件進行顯著性方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1片劑營養(yǎng)組分配比篩選

利用雙因素方差分析法篩選碳源、氮源配比,由表1可以看出不同比例碳源中,其濃度為10%時單位含菌量最高,方差分析結(jié)果(表2)顯示,F0.05(2,4)F0.01(2,4),因此,碳源影響非常顯著,由于碳源的用量越小菌落單位數(shù)越多,因此選取碳源濃度為10%。同時F氮源=1.021

2.2固體劑型菌含量穩(wěn)定性測定

顆粒劑初始含菌量為5×104cfu/g,片劑初始含菌量為8.3×105cfu/g。不同溫度條件保存下檢測結(jié)果顯示:顆粒劑和片劑在4℃保存時效果更好,其菌含量在120 d以后仍分別保持在2×103和2×104cfu/g;在28℃保存下,分別在第45天和第90天即檢測不到活菌的存在(表3)。

表1　不同碳氮源含量對菌含量的影響

表2　碳氮源配比方差分析1)

1) “*”表示在P<0.05水平上顯著性差異。

* Indicate significant difference atP<0.05.

表3　不同溫度下保存不同時間固體劑型的菌含量

2.3不同劑型溫室防治效果

采用苗期針刺法結(jié)合打頂法接種,空白對照組10 d后開始出現(xiàn)單側(cè)葉卷曲癥狀,20 d后出現(xiàn)不同的系統(tǒng)癥狀,發(fā)病率達到85%。各處理發(fā)病情況如表4所示:其中10×稀釋發(fā)酵液、發(fā)酵固體5 g、片劑1 g處理防病效果均可達到80%以上,顯著優(yōu)于對照藥劑處理。由此可以證明,由生防菌株Z-L-22開發(fā)的各種劑型均能抑制番茄潰瘍病的發(fā)生,防治效果顯著優(yōu)于對照藥劑。

2.4田間試驗結(jié)果

2.4.1土壤中鏈霉菌Z-L-22增殖情況測定

采用抗生素標記法測定鏈霉菌Z-L-22在番茄根際周圍土壤中的定殖能力,結(jié)果顯示,10×發(fā)酵液灌根在早期表現(xiàn)出較高活性,在45 d時定殖量達到最大,隨后菌含量開始減少;而固體顆粒劑和片劑在早期活性相對較低,但表現(xiàn)出更長的持效期,在60 d時達到最大活菌數(shù)(圖1),隨后生防菌在土壤中的含量開始下降,發(fā)酵液處理到75 d時,固體顆粒劑和片劑處理到90 d時,檢測不到活菌,其中片劑在土壤中的增殖能力更強。由此可以證明鏈霉菌Z-L-22可以在土壤中定殖。

2.4.2田間藥效試驗

在望都縣番茄大棚內(nèi),于番茄定植時(2014年3月3日)分別使用10×發(fā)酵液(水劑)灌根、顆粒劑和片劑穴施。結(jié)果如表5所示,在番茄定植45 d后(4月18日)進行調(diào)查,3種劑型防效均為100%。定植后75 d(5月17日),水劑處理相對防效為62.09%,而固體顆粒劑和片劑防治效果均達到80%以上,優(yōu)于水劑,定植105 d后(6月17日)調(diào)查結(jié)果顯示,顆粒劑和片劑相對防效可保持在55%以上,防病效果雖有所下降,但仍明顯優(yōu)于水劑和硫酸鏈霉素處理(表5)。

表4　溫室不同處理對番茄潰瘍病的防治效果1)

1) 同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著,大寫字母表示在P<0.01水平上差異顯著。

The small letters and capital letters in the same column indicate significant difference at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

圖1　生防菌株在根際土壤中定殖動態(tài)Fig.1　Colonization dynamics of biocontrol strains in rhizosphere soil in the field

3　討論

番茄潰瘍病在蔬菜種植區(qū)雖然不是大面積發(fā)生,但一旦發(fā)生便會造成植株萎蔫、葉片壞死,最后全株死亡。目前番茄潰瘍病的防治手段主要是種子消毒,但是對消毒后的種子保存要求較高[10],此外苗床消毒、高溫悶棚以及發(fā)病初期噴施化學(xué)藥劑也可在一定程度上控制該病的發(fā)生[11]。但以上手段在農(nóng)事操作上費時費力,且防治效果有限。

表5　不同處理對番茄潰瘍病的田間防治效果1)

1) 表中同列數(shù)據(jù)后小寫字母表示在0.05水平顯著性差異。

The small letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.

目前市場上僅有硫酸鏈霉素對番茄潰瘍病有一定的防效。本研究開發(fā)出生防菌Z-L-22的3種大田應(yīng)用劑型——水劑、顆粒劑和片劑,于苗期定植時進行處理均能對番茄潰瘍病起到較好的防治效果。發(fā)酵液(水劑)直接稀釋灌根,因其菌活性高、含量大,在生長早期表現(xiàn)出在土壤中優(yōu)秀的定殖能力,但水劑存放、運輸不便。顆粒劑在使用中若不能很好地與土壤混合均勻,往往造成藥害——燒根,導(dǎo)致植株生長緩慢。片劑則能克服上述問題,于番茄定植時用藥1次,即可使生防菌在番茄植株根系有效定殖,發(fā)揮防病、控病作用。片劑中初始菌含量也高于顆粒劑,并且由于片劑中加入適宜拮抗菌生長繁殖的碳源和氮源,因此可以在較長時間保持較高的含菌量,延長了持效期[6]。同時片劑還具有運輸、攜帶、應(yīng)用方便,劑量準確等優(yōu)點[12],對于控制番茄潰瘍病具有很好的應(yīng)用前景。

因Z-L-22活菌及其發(fā)酵產(chǎn)物對番茄潰瘍病菌均有較好的拮抗作用[4],而且具有較好的根際定殖能力,在持效期內(nèi)可保證對病害的控制作用。分析其可能主要通過在番茄植株體內(nèi)、外對病原菌的抗生、競爭作用,導(dǎo)致病原菌群體密度以及致病性下降。60 d后活菌數(shù)開始下降,可能是試驗地塊后期其他處理措施對土壤中的活菌有抑制作用,同時制劑中的營養(yǎng)元素消耗殆盡,而自然土壤不能維持生防菌生長所需。

本研究開發(fā)的生防制劑可有效降低番茄潰瘍病發(fā)病率,并能使已經(jīng)發(fā)病的植株繼續(xù)生長、結(jié)果,最終使該病害不再向外擴散,發(fā)病區(qū)病害減輕或不發(fā)生。同時在試驗中發(fā)現(xiàn)由于番茄植株在后期個體高大,生防菌劑對番茄植株體內(nèi)病原物的影響受到限制,造成防效下降。因此在今后的生產(chǎn)中,可結(jié)合后期地上植株的噴霧,進一步提高防治效果。

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(責(zé)任編輯：田喆)

Control efficacy of Z-L-22 formulations to bacterial canker of tomato

Zhao Sai,Zhang Weihong,Li Jianyuan,Yang Wenxiang,Zhang Na,Liu Daqun

(Department of Plant Pathology, Agricultural University of Hebei, Biological Control Center of Plant Diseases and Plant Pests of Hebei Province, National Engineering Research Center for Agriculture in Northern Mountainous Areas, Baoding 071001, China)

Based on the strain ofStreptomycessetoniiZ-L-22 which has strong antagonism effect on bacterial canker of tomato, we developed three types of field application formulations-water agent, granules and tablets, and determined the best components of tablets. The control effect against bacterial canker of tomato was investigated in greenhouse and field. The results showed that control efficacy reached over 80% when 10 times diluted fermentation, 5 g solid, and 1g tablet were applied in the greenhouse. Field test demonstrated that the incidence and severity of the three formulations treatments were significantly lower than those of streptomycin sulfate treatment and blank control after 75 days. The tablets showed easy in storage and transportation, low cost and long effective period, so it had a good value for development.

bacterial canker of tomato;field control efficacy;formulations;biological control

20150410

20150515

河北省科技成果轉(zhuǎn)化項目(12820307D);河北省教育廳青年基金(Q2012010,QN20131094)

E-mail:zn0318@126.com,ldq@hebau.edu.cn

S 436.412.19

B

10.3969/j.issn.05291542.2016.03.046