自體脂肪基質(zhì)血管成分改善植皮效果的初步臨床實驗研究

毛曦媛 李華 程辰 李青峰

論著

自體脂肪基質(zhì)血管成分改善植皮效果的初步臨床實驗研究

毛曦媛 李華 程辰 李青峰

目的 在植皮術(shù)中輔以自體基質(zhì)血管成分（stromal vascular fraction，SVF）進行治療，觀察其植皮效果的改善情況。方法 于植皮術(shù)同時行脂肪抽吸術(shù)，取得患者自體脂肪組織，通過膠原酶消化后提取SVF；植皮區(qū)行患者自身對照，實驗組植皮區(qū)皮下注射SVF（1×105cells/cm2），對照組注射等量生理鹽水；術(shù)后1個月、3個月、6個月及12個月隨訪，觀察皮片彈性、色澤、質(zhì)地及回縮率。結(jié)果 2014年4月至2015年12月，共18例患者。SVF輔助植皮實驗組和對照組均未出現(xiàn)皮片存活不佳、壞死（P＞0.05）。隨訪結(jié)果顯示：術(shù)后6個月和12個月，實驗組較對照組色澤更接近取皮區(qū)正常皮膚（P＜0.05）；術(shù)后3個月和6個月，實驗組含水量均明顯高于對照組（P＜0.05）；術(shù)后3個月、6個月和12個月，實驗組皮片摩擦力均明顯低于對照組（P＜0.05）；術(shù)后3個月、6個月和12個月，實驗組皮片彈性優(yōu)于對照組（P＜0.05）；術(shù)后1個月和3個月，實驗組的皮片回縮率明顯低于對照組（P＜0.05）。結(jié)論 SVF輔助皮片移植可有效改善皮片色澤和質(zhì)地，明顯減少皮片回縮，是一種安全有效的方法。

基質(zhì)血管成分 皮片移植 皮片回縮

修復(fù)皮膚缺損的方法主要有皮片移植與皮瓣移植。皮片移植成功率高，操作簡便，對供區(qū)損傷小，但是存在術(shù)后回縮、皮膚色素沉著、質(zhì)地僵硬等問題，不適用于功能部位及影響美觀的部位；皮瓣雖然沒有皮片的這些缺點，但皮瓣存在供區(qū)損傷大，手術(shù)難度高，并且皮瓣術(shù)后常較臃腫，需進行后期修整。皮片移植后效果不佳主要是因為皮片回縮和皮片質(zhì)地改變，可能與皮膚膠原蛋白及皮下脂肪缺失有關(guān)。

脂肪是重要的皮下組織成分，對皮膚有支持營養(yǎng)等作用，脂肪組織中含有大量多能間充質(zhì)干細胞，即脂肪來源干細胞 （Adipose-derived stem cells，ASCs），能夠分化為中胚層來源的多種組織細胞［1］，促進組織再生、創(chuàng)面愈合及血管新生［2］。此外，ASCs還能分泌多種細胞因子［3］。

ASCs體外分離培養(yǎng)和臨床應(yīng)用，尚存在技術(shù)問題和相關(guān)的倫理問題，限制了ASCs的臨床應(yīng)用。

基質(zhì)血管成分 （Stromal vascular fraction，SVF）最早由Rodbell和Jones發(fā)現(xiàn)報道［4］，是脂肪組織經(jīng)過膠原酶消化和離心以后得到的細胞沉淀，它是富含脂肪來源干細胞的復(fù)合細胞群，其中包括ASCs、血管內(nèi)皮細胞、多種血細胞等細胞成分［5］，已在多項臨床實驗中得到應(yīng)用［6-7］。SVF最主要的優(yōu)點就是獲取簡便，無需體外培養(yǎng)，分離后就可直接利用。SVF被證實具有促進組織再生、愈合、血管化的能力［8］。

為了觀察SVF是否能改善皮片移植的效果，我們在前期動物實驗中利用SVF輔助皮片移植，觀察到早期皮片血供增加、皮片存活率增高；遠期皮片回縮率降低、皮片質(zhì)地改善；組織學(xué)觀察到皮片下膠原組織增多、多種促血管生成的細胞因子分泌增加。這些結(jié)果提示，SVF輔助皮片移植能有效改善皮片移植的效果［9］。

為了進一步觀察SVF輔助皮片移植在臨床應(yīng)用中的效果，我們進行自身對照的臨床實驗，在植皮同時輔助自體脂肪SVF移植，術(shù)后隨訪，觀察皮片彈性、色澤、質(zhì)地及回縮率，評價SVF輔助皮片移植對皮片移植效果的改善作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

注射用膠原酶 （上海喬源生物制藥有限公司），鹽酸利多卡因注射液（麗珠集團利民制藥廠），鹽酸腎上腺素注射液 （東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司）。

Cutometer dual MPA 580皮膚測試儀（Courage+Khazaka，德國），恒溫?fù)u床 （太倉市華美生化儀器廠），離心機（Thermo Scientific，美國），離心管（BD，美國），40 μm濾網(wǎng)（BD，美國），10 mL移液管（Corning，美國），通用移液管（Thermo Scientific，美國）。

1.2 倫理審議及患者知情同意

本實驗通過我院倫理委員會倫理審議 ［滬九院倫審（2014）20號］。術(shù)前告知患者實驗?zāi)康摹嶒瀮?nèi)容、可能出現(xiàn)的情況及處理原則，患者表示理解并簽署知情同意書。

1.3 病例招募

病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①雙側(cè)對稱部位或者同一部位多處行植皮術(shù)患者，一側(cè)為對照組，不加干預(yù)；一側(cè)為治療組，給予SVF干預(yù)；或一側(cè)肢體上多個手指植皮術(shù)患者，隨機選擇其中部分手指進行干預(yù)，其余手指為對照組；②身體健康無基礎(chǔ)疾病；③有良好的供皮區(qū)，同一供皮區(qū)能滿足多處創(chuàng)面修復(fù)。

病例排除標(biāo)準(zhǔn)：①不適合行皮片移植者，或供皮區(qū)存在不適宜切取皮片者，如感染、血運障礙、延期愈合史、軟組織活力下降、放療史或?qū)⒔邮芊暖煛⒒顒有詽兊龋虎诤喜?yán)重內(nèi)科疾病（如糖尿病、肝炎、冠心病、動脈硬化、腎小球腎炎、自身免疫性疾病等），或存在心、肺、肝、腎功能不良，經(jīng)外科醫(yī)生評定不能夠耐受手術(shù)風(fēng)險者；③BMI＞30的肥胖癥患者；④有長期吸煙史，并且目前仍吸煙者；⑤孕婦及哺乳期婦女；⑥有精神性疾病、無自知力、不能確切表達及合作者；⑦未簽署知情同意書者；⑧正參加其他臨床實驗的患者；⑨其他研究人員認(rèn)為不適合參加臨床實驗的患者。

1.4 病例的隨機化與分組

將患者編號，按照隨機數(shù)字表，將患者植皮區(qū)按左右兩邊隨機分為實驗組和對照組。

1.5 脂肪抽吸手術(shù)及SVF分離提取

常規(guī)抽脂方法抽吸患者腹部脂肪約50～60 mL，吸出的脂肪靜置分層，用0.9%氯化鈉注射液清洗2～3次，去除下層液體。將抽取的脂肪液混合原酶，消化時濃度為0.02%，置離心管中，37℃消化1 h，然后置于離心機中，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入10 mL 0.9%氯化鈉注射液重懸，40 μm濾網(wǎng)過濾，置于離心機中1 500 r/min離心5 min，洗滌2～3次，得到沉淀細胞集合即為SVF。

1.6 SVF移植

在植皮區(qū)打包前，以1mL針管將獲得的SVF均勻注于實驗組皮片與植皮受區(qū)之間隙處，同時輔以輕柔按摩促進SVF均勻分散作用于受區(qū)。1 cm2植皮區(qū)域注射SVF細胞數(shù)量約1×105cells/cm2，對照組植皮區(qū)注射等量0.9%氯化鈉注射液，植皮區(qū)打包加壓固定。

1.7 病例隨訪及檢測

植皮術(shù)后1個月、3個月、6個月和12個月隨訪受試者。使用Cutometer dual MPA 580皮膚測試儀檢測移植皮片和皮片供區(qū)周圍正常皮膚的質(zhì)地，皮膚測試儀含有不同測試探頭，可分別測試彈性、含水量、色素、摩擦力、溫度等指標(biāo)。使用皮膚檢測儀前，對應(yīng)探頭需連接Cutometer dual MPA 580主機，每次于同一皮片表面的不同部位測試3次，取平均值。所測試的部位分別為：實驗組皮片；對照組皮片；取皮區(qū)正常皮膚。

每次隨訪時用透明薄膜覆蓋植皮區(qū)，然后使用記號筆在透明薄膜上沿著植皮區(qū)邊緣描畫出雙側(cè)植皮區(qū)范圍，沿邊緣裁剪后置于深色背景下，用同一數(shù)碼相機設(shè)置相同參數(shù)以相同高度進行拍攝，之后存入電腦，使用繪圖分析軟件AutoCAD進行分析比較，計算皮片的回縮率。

觀察并記錄是否出現(xiàn)皮片血供不佳、愈合不良或者感染等情況，評價SVF輔助植皮的安全性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 病例入組情況

2014年4月至2015年12月，入組受試者共18人，男、女各9例，年齡3～60歲。均行全身多處對稱部位植皮手術(shù)或者同一部位多處植皮手術(shù)。所有患者第1個月均回訪，最早入組的受試者已完成12個月隨訪，最晚入組的受試者已完成3月隨訪，4名受試者完全失隨訪。

術(shù)前均按照實驗設(shè)計隨機將植皮受區(qū)分成實驗組和對照組，術(shù)前常規(guī)拍照，并記錄受試者完整信息。植皮手術(shù)由同一組醫(yī)師完成，術(shù)中所需的脂肪組織獲取和SVF提取由另一位醫(yī)師單獨完成，術(shù)后隨訪則由同一位醫(yī)師完成（圖1）。

圖1 植皮手術(shù)及SVF移植Fig.1 Skin grafting and SVF transfer

2.2 皮膚測試儀測試移植皮片質(zhì)地

皮膚測試儀測試植皮皮片和供皮區(qū)的色素、含水量、摩擦力、溫度等指標(biāo)。

隨訪發(fā)現(xiàn)，實驗組移植皮片色素沉著減少，其顏色更接近于取皮區(qū)正常皮膚顏色，在植皮后期6個月和12個月隨訪時實驗組較對照組有明顯改善（P＜0.05）；含水量方面，移植皮片實驗組從第3個月隨訪起，皮片含水量均高于對照組皮片，并且在植皮恢復(fù)期（3個月、6個月）時，實驗組皮片含水量明顯高于對照組（P＜0.05）。移植皮片的摩擦力即皮片的光滑程度，摩擦力越大，皮片越粗糙。在隨訪早期即觀察到實驗組皮片光滑程度有明顯改善，從隨訪第3個月至第12個月時，實驗組皮片摩擦力均明顯低于對照組（P＜0.05）；移植皮片的溫度在隨訪過程中保持穩(wěn)定（圖2）。

圖2 植皮皮片的色素、含水量、摩擦力及溫度Fig.2 The skin color，water content，friction and skin temperature of the grafted skin

2.3 皮膚測試儀測試移植皮片彈性

皮膚測試儀測試植皮皮片和供皮區(qū)皮膚的彈性，兩組移植皮片之間進行對比。隨訪結(jié)果顯示，實驗組皮片彈性均優(yōu)于對照組皮片，并且在皮片移植后第3個月起即有明顯改善（P＜0.05），實驗組皮片彈性更接近于取皮區(qū)正常皮膚的彈性（圖3）。

圖3 移植皮片彈性測試結(jié)果Fig.3 The elasticity of the grafted skin

2.4 移植皮片回縮率

皮片移植后回縮是皮片移植的難點，移植的皮片越薄，回縮越嚴(yán)重，特別是關(guān)節(jié)周圍的皮片移植。

各個隨訪時間點，實驗組回縮率均低于對照組，第1個月和第3個月時有統(tǒng)計學(xué)差異。植皮皮片在隨訪第1個月時回縮率，實驗組為（2%±1.0%），對照組為（12%±1.6%），P＜0.05；第3個月時回縮率，實驗組為（12.5%±3.35%），對照組為（25%±5.0%），P＜0.05（圖4）。

圖4 植皮皮片回縮率Fig.4 The contracture of the grafted skin

2.5 SVF輔助皮片移植的安全性

本組患者術(shù)后均未出現(xiàn)皮片血運障礙、愈合不良、皮片感染或者皮片壞死等情況。隨訪時，患者植皮皮片均存活良好，未有局部皮溫異常，皮片及周圍未見紅腫感染等。抽脂部位部分患者可有局部青紫，1個月后消退，未有其他不適。SVF輔助皮片移植不影響皮片存活。

3 討論

SVF來源于脂肪組織，內(nèi)含有多種組織細胞，其中最重要的細胞成分為ASCs［10］，擁有可誘導(dǎo)分化成多種組織細胞的能力和增殖能力，ASCs強大的內(nèi)分泌能力是其發(fā)揮作用的主要方式之一［11］。ASCs作為成體干細胞，其使用和倫理限制較胚胎干細胞少，但是分離提取比較復(fù)雜，需要體外培養(yǎng)［12］。實驗室使用的培養(yǎng)液添加胎牛血清，有攜帶病原、污染細胞的風(fēng)險，體外培養(yǎng)也可能因各種操作等原因?qū)е录毎只妥儺悾粼俅畏祷厝梭w進行干預(yù)處理，存在諸多安全隱患。這些都限制了ASCs在人體疾病治療方面的應(yīng)用。而SVF來源于脂肪組織，是一類多細胞的集合，無需體外培養(yǎng)，其分離提取的步驟簡單，分離和處理可全程無菌操作，降低了分離提取污染的概率，同時分離時間較短，可直接在手術(shù)同時進行［13］，避免多次手術(shù)伴隨的其他風(fēng)險。SVF無需培養(yǎng)即可直接應(yīng)用，避免了使用異種血清涉及的倫理問題。

SVF及ASCs已廣泛應(yīng)用于燒傷和整形外科領(lǐng)域的組織創(chuàng)傷修護和瘢痕修復(fù)中，如乳房軟組織缺損［13］、面部瘢痕［14］、半面萎縮［15］、足部難治性潰瘍［16］、皮膚創(chuàng)傷［17］等；其他方面，如多發(fā)性硬化癥［18］、退行性關(guān)節(jié)炎［19］、骨軟骨缺損［20］等也有大量研究應(yīng)用。這些都證明了SVF和ASCs具有減少組織缺血缺氧、促進血管新生和促進組織再生的能力。我們前期的動物實驗中發(fā)現(xiàn)，SVF能在早期促進皮片存活，增加皮片的血供［9］，并且在后期減少皮片的回縮，同時增加了皮片的柔軟度。

本臨床實驗在植皮手術(shù)同時抽取受試者自體脂肪組織進行消化處理，術(shù)中即可獲得SVF，方法簡單，且不增加正常手術(shù)時間。少數(shù)患者抽脂部位局部出現(xiàn)青紫，這屬于抽脂后正常現(xiàn)象，多數(shù)在1個月之內(nèi)便可自行恢復(fù)。

本組患者術(shù)后未見皮片愈合不佳或感染壞死等，實驗組和對照組均存活良好。

皮膚質(zhì)地的測試是通過皮膚測試儀完成的，我們使用的皮膚檢測儀是德國Courage+Khazaka公司生產(chǎn)的Cutometer dual MPA 580皮膚測試儀，配備了測試彈性、色素、水分、摩擦力和溫度的探頭。Cutometer dual MPA 580皮膚測試儀測試各項指標(biāo)的原理都不同：彈性測試是通過一定的負(fù)壓作用于皮膚，記錄皮膚的變形能力和回復(fù)至正常位置的能力；色素是測試皮膚的黑色素和血紅素的含量，皮膚的顏色主要是這兩種色素決定的，測試是基于光的吸收原理，測試探頭發(fā)出三種特定波長的光，接收器接受皮膚反射的光并處理得到的數(shù)據(jù)；皮膚水分的測試是基于電容法，這種方法是根據(jù)水的介電常數(shù)和其他物質(zhì)的介電常數(shù)不同，測試電容器按照皮膚水分含量的不同顯示出電容量的變化從而計算出水分含量；皮膚摩擦力測試是測試探頭內(nèi)部有個微型電動機和齒輪轉(zhuǎn)動裝置，當(dāng)探頭在不同的皮膚表面測試時，因皮膚表面的摩擦力不同，電機轉(zhuǎn)動需要的扭矩則不同，皮膚越光滑電機轉(zhuǎn)動需要的扭矩就越小，根據(jù)不同皮膚表面測得的扭矩計算出皮膚摩擦力；皮膚的溫度測試則是利用特殊的傳感器接收皮膚表面發(fā)出的紅外線來測試皮膚表面的溫度，是一種皮膚表面溫度的非接觸式測量方法。此皮膚測試儀測試原理科學(xué)、結(jié)果穩(wěn)定可靠，已在多項臨床實驗中用于皮膚質(zhì)地的測試和評價［21-22］。

我們利用皮膚檢測儀檢測了皮片彈性、色素沉著、皮片的含水量、皮片表面的摩擦力還有皮片溫度，觀察到實驗組皮片質(zhì)地較對照組有明顯改善。

植皮后皮片回縮一直是植皮技術(shù)難以解決的問題，臨床上觀察到皮片厚度越薄，術(shù)后回縮越嚴(yán)重。目前認(rèn)為，皮片早期回縮是與皮片中彈性纖維含量有關(guān)，全厚皮片所含的彈性纖維多，早期回縮率大于刃厚皮片；而晚期回縮主要是由于創(chuàng)面回縮引起的，此時，皮片越厚越硬，回縮越小。Kucukkaya等［23］在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，在皮片移植時，植皮部位注射肉毒毒素能減少創(chuàng)面周圍及基底部回縮，并促進皮片下成熟的膠原組織形成，有效降低移植皮片的回縮率。這可能與肉毒素減少創(chuàng)面基底和周圍肌肉回縮，減少了對皮片的回縮牽拉有關(guān)。另一影響因素則是皮片的早期血供情況［2］，皮片血供良好則存活良好、回縮較小，動物實驗表明，利用ASCs輔助皮片移植能有效改善創(chuàng)面血供，促進創(chuàng)面愈合，減少創(chuàng)面回縮率［24］。

我們發(fā)現(xiàn)，各個隨訪時間點，實驗組回縮率均低于對照組，第1個月和第3個月時有統(tǒng)計學(xué)差異。我們所有受試者在完成植皮手術(shù)拆線后，都定做了支架，在康復(fù)醫(yī)師的指導(dǎo)下，每日堅持佩戴支架并進行牽拉鍛煉。早期皮片回縮主要與彈性纖維回縮有關(guān)，這種回縮可通過持續(xù)支架牽拉和鍛煉改善，而晚期皮片回縮主要是與皮片基底創(chuàng)面回縮有關(guān)。早期，SVF中的ASCs能分泌多種促血管生成因子，促進局部組織的抗缺血缺氧能力和生產(chǎn)血管的能力［25］，減輕了早期皮片因缺血缺氧導(dǎo)致的存活不佳，促進早期皮片的存活，減少皮片的回縮率。我們觀察到SVF輔助皮片移植降低了皮片的回縮率，但在術(shù)后6個月和12個月時，雖然數(shù)值上實驗組回縮率低于對照組，但是沒有統(tǒng)計學(xué)差異，這可能與手術(shù)時輔助移植的SVF的量有關(guān)，若手術(shù)時增加SVF單位皮片面積的用量或者在6個月時再次獲取SVF用于皮片區(qū)的治療，可能能進一步降低皮片的遠期回縮率。

4 結(jié)論

SVF輔助皮片移植能夠有效改善植皮后的皮片質(zhì)地，減少皮片回縮，并且方法簡單，安全可行。

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Effect of Autologous Stromal Vascular Fraction （SVF）in Adipose Tissue on Skin Grafting

MAO Xiyuan，LI Hua，CHENG Chen，LI Qingfeng.Department of Plastic and Reconstructive Surgery，Shanghai Ninth People's Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 20011，China.Corresponding author：LI Qingfeng
（E-mail：dr.liqingfeng@shsmu.edu.cn）.

Objective To explore the improving effect of autologous stromal vascular fraction （SVF）in adipose tissue on skin grafting.Methods The adipose tissue was harvested at the same time of skin grafting，then digested and processed；SVF （1×105cells/cm2）was obtained and injected into the grafted skin as the treatment group，while saline was injected as self-control；The elasticity，color，texture and contracture of skin grafts were observed and measured 1 month，3 months，6 months and 12 months after operation.Results From April 2014 to December 2015，18 patients were enrolled.No necrosis of skin grafts was observed in both control group and treatment group（P＞0.05）.During the follow-ups，compare to the control group，the skin color of the treatment group was more similar to the normal skin 6 months and 12 months after operation （P＜0.05）；The skin water content of the treatment group was higher than that of the control group 3 months and 6 months after operation （P＜0.05）；Compare to the control group，the frictional force and the skin elasticity of the treatment group were both improved 3 months，6 months and 12 months after operation （P＜0.05）；The contracture rate of the treatment group was lower than that of the control group 1 month and 3 months after operation （P＜0.05）.Conclusion The transplantation of SVF is a safe and effective method for skin grafting by improving skin color，texture and reducing skin contracture.

Stromal vascular fraction；Skin grafting；Skin retraction

·論著·

R622

A

1673－0364（2016）04－0207－06

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.04.001

國家科技支撐計劃（2012BAI11B03）。

200011 上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

李青峰（E-mail：dr.liqingfeng@shsmu.edu.cn）。

（2016年3月24日；

2016年5月9日）