雞肉干中金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺殘留量的測定

王智瑋

(上海天祥質量技術服務有限公司，上?！?00233)

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雞肉干中金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺殘留量的測定

王智瑋

(上海天祥質量技術服務有限公司，上海200233)

采用固相萃取柱對樣品中的金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺進行濃縮與凈化，建立了一種靈敏測定雞肉干中金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺殘留量的超高效液相色譜-質譜串聯儀法。試驗結果表明，采用MCX固相萃取柱進行富集與凈化，金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺在1～20 μg/L濃度范圍內與其響應值呈良好的線性關系，檢出限均為0.5 μg/kg。該方法分析速度快，靈敏度高，重復性好，適用于動物源食品中金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺殘留量的測定。

金剛乙胺；3,5-二甲基金剛胺；美金剛；超高液相色譜-串聯質譜法

金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺，屬于金剛烷胺類，3,5-二甲基金剛胺又稱美金剛。金剛烷胺類屬于三環胺類抗病毒藥物，在人類上有廣泛應用。據其藥理作用，國內現在主要將金剛烷胺類藥物用于雞、豬流感的預防和早期治療，及豬傳染性胃腸炎的防治。但是，將人用抗病毒藥物用于畜禽，不僅容易導致動物性食品中藥物殘留、動物中毒、動物機體產生免疫抑制和耐藥性等問題，還可導致病毒發生變異， 影響動物疫病控制及人用抗病毒藥物的有效性[1-3]。我國于2005 年 12 月發布《關于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》，禁止金剛烷胺等抗病毒藥作為獸用藥，但由于其價格低廉、效果良好，仍有不法分子大量使用金剛烷胺類藥物用于動物疾病的預防和治療。濫用金剛烷胺類藥物會導致動物中毒，使病毒產生不同程度的耐藥性，并誘發病毒產生變異，嚴重影響了國家動物疫病防控工作[4]。我國對于動物源性食品中金剛烷胺殘留含量的相關研究報道較少，少數的報道主要集中在液相色譜法[5]、氣相色譜法[6-10]和液相色譜-串聯質譜法[11-15]，也未曾制定或立項過國家標準。因此，研究建立動物源食品中金剛烷胺類的殘留檢測方法具有重要意義。

1　實　驗

1.1儀器與試劑

AB 4500超高效液相色譜-質譜聯用儀；XS105分析天平，METLER；XW-80A渦旋混合器，上海精科；SF-DL-4M冷凍離心機，上海菲恰爾分析儀器有限公司；SK3300HP超聲波清洗器，KUDOS；N-EVAP111氮吹儀，ASSOCIATES；57265固相萃取裝置，SUPELCO。

甲醇、異丙醇和甲酸為色譜純，鹽酸、正己烷、三氯乙酸、氨水和乙酸銨為分析純，實驗用水為去離子水。鹽酸金剛乙胺、3,5-二甲基金剛胺和鹽酸金剛烷胺-D15,購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2標準溶液配制

1.2.1標準儲備液

準確稱量1.0 mg金剛烷胺-d15標準品至5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，混勻，濃度為200 μg/mL。-18 ℃保存12個月。

分別準確稱量金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺標準品至50 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，混勻，濃度均為200 μg/mL。-18 ℃保存12個月。

1.2.2標準中間液

精確吸取金剛烷胺-d15儲備液0.25 mL至50 mL的容量瓶中，用甲醇定容，混勻，濃度為1.0 μg/mL。-18 ℃保存6個月。

精確吸取標準儲備液0.25 mL至50 mL的容量瓶中，用甲醇定容，混勻，金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺濃度均為1.0 μg/mL。-18 ℃保存6個月。

1.2.3標準工作液的配制

從標準中間液中分別吸取0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL至10 mL容量瓶中，再從金剛烷胺-d15標準中間液中分別吸取0.25 mL至10 mL容量瓶中，用水定容，混勻，金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺濃度為1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL，內標金剛烷胺-d15濃度為25.0 ng/mL。標準工作液現配現用。

1.3樣品制備

準確稱取2 g(精確到0.01 g)試樣至50 mL塑料離心管中，加入內標(金剛烷胺-D15，濃度為1.0 μg/mL)0.025 mL，再加入10 mL甲醇：1%三氯乙酸(1:1)，渦旋振蕩1 min，超聲30 min，4000 r/min冷凍離心15 min。上清液轉移至另一50 mL 離心管中，加入5 mL正己烷輕微振搖3 min，4000 r/min冷凍離心5 min，除去上層正己烷層，取下層液待凈化。取下層液轉移至已活化(用3 mL甲醇，3 mL水活化)MCX固相萃取柱中，依次用3 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液、3 mL甲醇淋洗，棄去全部流出液，在負壓下干燥5 min，然后用5 mL氨水-甲醇-異丙醇(5+80+15)洗脫。收集洗脫液于45 ℃ 氮吹至干，精密加入1 mL水至殘渣中，渦旋振蕩溶解殘渣，如渾濁，以13000 r/min離心10 min，取上清液供LC-MS/MS測定。

1.4儀器條件

1.4.1液相條件

色譜柱：C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)或相當者；

流動相：A相5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)，B相甲醇。

流速：0.3 mL/min；

進樣量：5 μL；

柱溫：30 ℃。

表1　流動相梯度條件Table 1　The elution conditions of mobile phase

1.4.2質譜條件

離子源：電噴霧ESI離子源；

掃描方式：正離子掃描；

檢測方式： MRM；

電噴霧電壓：5500 V ；

霧化氣壓力：50 psi；

氣簾氣壓力：35 psi；

輔助氣壓力：50 psi；

碰撞氣壓力：9 psi；

離子源溫度：500 ℃；

碰撞室入口電壓：10 V；

碰撞室出口電壓：6 V。

監測離子對情況見表2。

表2　金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺及金剛烷胺-d15的離子對Table 2　The MS parameters for detecting rimantadine and memantine

2　結果與討論

2.1線性關系及檢出限

表3　測試結果Table 3　Testing results of calibration curve

圖1　金剛乙胺標準曲線Fig.1　The standard curve of rimantadine

圖2　3,5-二甲基金剛胺標準曲線Fig.2　The standard curve of memantine

準確移取金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺儲備液適量，用水稀釋成一系列的標準工作液，其濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 μg/L。以標準溶液中被測組分峰面積為縱坐標，以濃度為橫坐標，繪制標準曲線。平行測定10次空白試劑加標(1.0 ng/mL)的標準偏差為Sb，檢出限CL=3Sb，得出該方法的檢出限為0.5 μg/kg。

線性方程為：

金剛乙胺：y=0.03498x+0.00537 (r=0.99974)

3,5-二甲基金剛胺:y=0.02640x+-0.00168(r=0.99985)

2.2回收率

本方法選擇雞肉干作為加標基質。分別選取0.5 μg/kg、2.5 μg/kg、10 μg/kg進行加標回收實驗，每個水平重復測定7次，加標情況見表4、表5，回收率見表6、表7。

表4　雞肉干中金剛乙胺的加標情況Table 4　Measured values of Rimantadine in chicken dry

表5　雞肉干中3,5二甲基金剛胺的加標情況Table 5　Measured value of Memantine in chicken dry

表6　雞肉干中金剛乙胺加標回收Table 6　The recovery rate of Rimantadine in chicken dry

表7　雞肉干中3,5-二甲基金剛胺加標回收Table 7　The recovery rate of Memantine in chicken dry

表8　基質加標一覽表Table 8　The recovery rate list

2.3實驗譜圖

2.3.1標準物質色譜圖(0.5 ng/mL)

圖3　0.5 ng/mL標準物質色譜圖Fig.3　The UPLC-MS/MS of rimantadine and memantine (0.5 ng/mL)

金剛乙胺和3,5二甲基金剛胺為同分異構體，4.85 min為金剛乙胺，5.02 min為3,5-二甲基金剛胺。

2.3.2空白基質色譜圖(雞肉干)

圖4　空白基質色譜圖(雞肉干)Fig.4　The UPLC-MS/MS of blank sample(chicken dry)

2.3.3空白樣品(雞肉干)加標色譜圖(加標濃度0.5 μg/kg)

圖5　空白樣品加標色譜圖Fig.5　The UPLC-MS/MS of rimantadine and memantine in samples after adding standard concentration

2.4精密度分析

同回收率部分選擇雞肉干作為加標基質。進行三個水平加標回收實驗，每個水平重復測定7次，基質添加回收的變異系數(CV)與GB/T 27404-2008要求的變異系數(CV)范圍比較見表9和表10。

表9　基質添加回收的變異系數與GB/T 27404-2008要求的 變異系數范圍比較(金剛乙胺)Table 9　The comparison of coefficient of variation (rimantadine)

表10　基質添加回收的變異系數與GB/T 27404-2008要求的 變異系數范圍比較(3,5-二甲基金剛胺)Table 10　The comparison of coefficient of variation (memantine)

3　結　論

本實驗采用弱酸性溶液提取，固相萃取法進行凈化與富集，運用UHPLC-MS/MS技術對金剛乙胺和3,5-二甲基金剛胺進行測定。固相萃取法能夠更有效的分離分析物與雜質，回收率以及富集倍數高，有毒溶劑用量少，通過簡單的操作就能達到無相分離，提升了前處理操作安全性，節省了前處理時間，提高了實驗效率。本法的檢出限、回收率、精密度能夠滿足實驗要求。相較傳統的化學方法而言，本方法快速、高效、重現性好，可以應用于常規分析檢測。

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Determination of Rimantadine and Memantine Residues in Chicken Dry by UHPLC-MS/MS

WANG Zhi-wei

(Shanghai Intertek Testing Services Co., Ltd., Shanghai 200233, China)

A simple, fast, accurate method for determination of rimantadine and memantine in chicken dry was developed by ultra high performance liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The sample was concentrated by solid phase extraction column. The linear range of the method was from 1 μg/L to 20 μg/L with a good correlation coefficient, and the detection limit was 0.5 μg/kg. The proposed method exhibited high sensitivity and good reproducibility for determining rimantadine and memantine.

rimantadine;3,5-dimethyl amantadine; memantine; UHPLC-MSMS

王智瑋(1990-)，檢測工程師，主要從事食品檢測。

TS207.3

A

1001-9677(2016)09-0120-04