基于毛細管電泳的胡椒堿光誘導異構化反應研究*

惠　陽， 陳文豪

(海南師范大學化學與化工學院，熱帶藥用植物化學省部共建教育部重點實驗室， 海南　海口　571127)

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基于毛細管電泳的胡椒堿光誘導異構化反應研究*

惠陽， 陳文豪

(海南師范大學化學與化工學院，熱帶藥用植物化學省部共建教育部重點實驗室， 海南海口571127)

基于高效毛細管電泳平臺研究了胡椒中胡椒堿的光誘導順反異構化反應，并依次考察了可能對反應效果產生影響的幾種因素，并計算了反應的速率常數。通過實驗，觀察到溶液濃度較小的溶液光誘導異構化反應越容易進行；考察不同波長的光源，發現僅有大于反應物本身最大吸收波長的光源才能引發光誘導異構化反應；另外延長照射時間到一定程度，光誘導異構化反應進行越完全，而一旦達到反應平衡狀態，則反應物不再減少，相應的產物也不再增多；另外值得注意的是，用丙酮溶劑溶解反應物，發現對光誘導異構化反應有一定程度的抑制作用，推測是因為該種溶劑的結構含有能吸收紫外光的官能團；計算得到反應速率常數k為0.077 min-1。

光誘導異構化；毛細管電泳；胡椒堿

現代藥理研究表明，胡椒中所含胡椒堿具有抗菌[1]、抗癌[2]、抗抑郁[3]、止瀉[4]、抗氧化[5]、殺蟲[6]、抗潰瘍[7]、抗驚厥作用[8]等作用。基于以上藥理活性，胡椒堿是一種極其具有發展前景的抗癌、保護心血管和肝臟的免疫調節天然藥品。

胡椒堿屬于酰胺類化合物，其分子結構見圖1，具有兩個烯鍵。其光穩定性差，在紫外光照射下，很容易發生順反異構化反應而轉化為另外三種順反異構體[9-10]。而這三種異構體的生物活性與胡椒堿存在一定差異[11]，因此由自然光照就能誘導產生的異構化反應引起的失活效應，極有可能限制胡椒的應用。針對胡椒堿的分析，目前已有核磁共振[12]、振動光譜[13]、紫外光譜[14]及高效液相色譜[15-16]和色質聯用[17-18]及薄層色譜[19]等研究報道，但分離時間長且未達到基線分離。海南省作為我國胡椒種植主產區，產量占全國總產的80%，產值居熱作產品前列，本文采用毛細管電泳這一現代分離分析新技術對胡椒中所含的具有抗菌抗癌活性的胡椒堿類成分進行系統的分離鑒定，研究日光及紫外光照射等條件對其活性的影響，并利用該體系研究光誘導異構化的反應動力學。

1　實　驗

1.1儀器與試劑

Agilent7100毛細管電泳儀，配備二極管陣列檢測器(檢測波長范圍190～600 nm)。分離用石英毛細管長48 cm(有效長度40 cm)、內徑50 μm、外徑375 μm，購于Agilent。第一次使用的毛細管要依次用甲醇、0.1 M的NaOH和水分別沖洗10、5、15 min，然后再用分離緩沖溶液沖洗10 min。過夜后每次實驗之前也需用0.1 M NaOH溶液、水及分離緩沖溶液再依次沖洗5、1、3 min。每單次運行前，仍需用蒸餾水及分離緩沖溶液各自沖洗2 min。另外，所有進入毛細管的溶液都需要經由0.45 μm孔徑的膜過濾后方可使用。樣品的進樣時間設為5 s，進樣壓力設為0.5 psi。

WFH-203型雙波長紫外分析儀用于提供254和365 nm的照射光源。胡椒堿標準品購自Sigma-Aldrich。胡椒堿的光學異構體容易受光照影響而變質，因此無法購買到商業標準品。根據文獻方法，三種異構體均由100 μM的胡椒堿標準品通過紫外光照而得到，并用高效液相色譜分離得到，核磁共振鑒定結構[10]。實驗所用其他試劑均為分析純級別。

1.2溶液配制

準確稱取胡椒堿標準品10.0 mg，在10.0 mL的甲醇-水混合溶劑中(體積比為1:1)配成質量濃度1.0 g/L的儲備液，樣品需放置在4 ℃下避光處。

1.3實驗方法

光照實驗所選波長為日光、紅外光、254 nm和365 nm紫外光。光照不同時間，計時結束后立即取出樣品，進行毛細管電泳-DAD分離檢測。

2　結果與討論

2.1毛細管電泳分離條件的優化

依次研究了分離緩沖溶液中的各個組分濃度對分離效果的影響，包括15、20、25、30 mM的硼砂、0、2、5 mM的β-CD及不同種類有機改性劑，包括5%～15% 的甲醇、乙腈、丙酮。并考察了分離緩沖溶液pH值(8.5～10.0)的影響。結果表明25 mM硼砂、13 mM SDS、10%甲醇、2 mM β-CD、pH 8.7為最佳電泳分離條件。胡椒堿標準品溶液在365 nm紫外光照射2 h后所得的異構體混合物的電泳譜圖如圖2所示。

圖2　胡椒堿標準品溶液光照不同時間后的異構體混合物的電泳圖Fig.2　The electropherogram of standard solution of after irradiation

2.2溶液濃度對異構化反應的影響

實驗考察了溶液中胡椒堿濃度大小對光誘導異構化反應的影響。依次用365 nm紫外光照射不同濃度的胡椒堿溶液相同時間后，發現在低濃度的溶液中，光誘導異構化反應更容易進行，反應速率較快。

2.3照射光源波長對異構化反應的影響

分別使用254 nm和365 nm紫外光、日光及紅外光源照射胡椒堿標準品溶液相同時間段。由圖3可知，日光和254 nm紫外光對順反異構有不同程度的影響，且胡椒堿的響應信號不斷減小的趨勢一致，而紅外光幾乎沒有什么影響。其中365 nm紫外光能較大程度地使得胡椒堿轉化為其順反異構體。可能因為在365 nm波長光源的作用下胡椒堿躍遷至激發態變型的幾率較高。

圖3　光源波長影響Fig.3　The effect of wavelength

2.4照射時間對異構化反應的影響

CE-DAD信號強度隨光照時間變化的曲線，從圖3中可以看出除紅外光之外，其他三種光源，隨照射時間延長，反應的趨勢都一致，在100 min之內胡椒堿信號明顯下降，而100 min以后，即使延長照射時間，胡椒堿的信號也不再有明顯變化。據文獻報道[11]雙鍵結構的光誘導異構化反應速率是光波長和強度的函數，這與我們的實驗結論吻合。

2.5溶劑對異構化反應的影響

考察了包括甲醇、乙醇、丙酮和水四種溶劑的影響。如圖4所示，甲醇溶劑中胡椒堿濃度下降速度最快，其次為乙醇和水，兩者區別并不明顯。而丙酮溶劑中光誘導異構化反應速率最慢。推測原因，可能是由于丙酮結構中帶有羰基，它作為發色團，可能會吸收一部分紫外光，導致胡椒堿轉化比例降低。

圖4　溶劑影響Fig.4　The effect of solvent

2.6異構化反應速率常數計算

據文獻[20]中的模擬方法，我們可以用k代表胡椒堿異構化反應的速率常數。設反應起始時的胡椒堿濃度為c0，光照時間為t，光照后的濃度設為ct，可知Δct為：

Δct=c0-ct

反應速率方程的微分式如下:

再對此式作不定積分可得：

Δct=Δcmax(1-e-kt)

(1)

其中的Δct指反應過t時間后的濃度變化值，Δcmax則指反應時間無限延長后，即反應達到平衡狀態后，反應物的濃度變化值。其次，峰吸光強度的大小和物質的濃度成正比：

ΔAt=ΔAmax(1-e-kt)

(2)

ΔAt指反應過t時間后的峰吸光強度變化值，而ΔAmax則指反應時間時間t無限延長后，也就是反應達到平衡狀態后時各個峰的吸光強度變化值。擬合實驗中所得各個數據，計算得到ΔAmax與反應速率k分別是55.34 mAU和0.077 min-1。

3　結　論

通過實驗，觀察到溶液濃度低的溶液光誘導異構化反應越容易進行；考察不同波長的光源，發現僅有大于反應物本身最大吸收波長的光源才能引發光誘導異構化反應；另外延長照射時間到一定程度，光誘導異構化反應進行越完全，而一旦達到反應平衡狀態，則反應物不再減少，相應的產物也不再增多；更值得注意的是，用丙酮溶劑溶解反應物，發現對光誘導異構化反應有一定程度的抑制作用，推測是因為該種溶劑的結構含有能吸收紫外光的官能團；這與我們之前對二苯乙烯類物質如白藜蘆醇、土大黃苷的光誘導異構化反應的特點有相似之處，具體可見文獻[22]。最后，通過模擬計算得到反應速率常數k為0.077 min-1。上述工作的完成，有望為作為我省主要經濟作物之一的胡椒的種植，保存，運輸，深加工提供科學依據。

[1]Khan I A, Mirza Z M, Kumar A, et al. Piperine, a phytochemical potentiator of ciprofloxacin against Staphylococcus aureus[J]. Antimicrob. Agents Chemother,2006, 50:810-812.

[2]Pradeep C R，Kuttan G. Effect of piperine on the inhibition of lung metastasis induced B16F-10 melanoma cells in mice[J]. Clin Exp Metastasis，2002,19(8):703-708.

[3]胡園，廖紅波，劉屏,等. 胡椒堿調節大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸抗抑郁作用的實驗研究[J]. 中西醫結合學報，2009,7(7):667-670.

[4]Bajad S, Bedi K L, Singla A K, et al. Antidiarrhoeal activity of piperine in mice[J]. Planta Med,2001, 67:284-287.

[5]Price S E，Harris S A D，Deborah J，et al. Piperine，an active ingredient of black pepper attenuates acetaminophen induced hepatotoxicity in mice[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine,2010,3(12):971-976.

[6]Scott I M, Gagnon N, Lesage L, et al. Efficacy of botanical insecticides from Piper species (Piperaceae) extracts for control of Ruropean chafer (Coleoptera: Scarabaeidae)[J]. J. Econ. Entomol,2005, 98:845-855.

[7]Morikawa T，Matsuda H，Yamaguchi I，et al. New amides and gastroprotective constituents from the fruit of Piper chaba[J]. Planta Med，2004,70: 152-159.

[8]D’Hooge R，Pei Y Q，Raes A，et al. Anticonvulsant activity of piperine on seizures induced by excitatiory amino acid receptor agonists[J]. Arzneimittel-Forschung，1996， 46(6):557-560.

[9]Ternes W，Krause E L. Characterization and determination of piperine and piperine isomers in eggs[J]. Anal Bioanal Chem，2002，374: 155-160.

[10]Kozukue N，Park M S，Choi S H，et al. Kinetics of lightinduced cis-trans isomerization of four piperines and their levels in ground black pepper as determined by HPLC and LC/MS[J]. J Agric Food Chem，2007，55: 7131-7139.

[11]黃鴻新, 羅一帆, 許旋. 桂皮酰胺類化合物分子扭角與抗驚活性的關系 [J]. 數理醫藥學雜志,1997,10 (3): 256-258.

[12]Catchpole O J, Grey J B, Perry N B, et al. Extraction of chili, black pepper, and ginger with near-critical CO2, propane, and dimethyl ether: analysis of the extracts by quantitative nuclear magnetic resonance[J]. J. Agric. Food Chem., 2003, 51:4853-4860.

[13]Schulz H, Baranska M, Quilitzsch R, et al. Characterization of peppercorn, pepper oil, and pepper oleoresin by vibrational spectroscopy methods[J]. J. Agric. Food Chem., 2005, 53:3358-3363.

[14]Lupina T, Cripps H. UV spectrophotometric determination of piperine in pepper preparations: collaborative study[J]. J. AOAC Int., 1987, 70:112-113.

[15]Wood A B, Barrow M L, James D J. Piperine determination in pepper (Piper nigrum L.) and its oleoresinssa reversed-phase high-performance liquid chromatographic method[J]. Flavour Fragrance J, 1988, 3:55-64.

[16]Wu S, Sun C, Pei S, et al. Preparative isolation and purification of amides from the fruits of Piper longum L. by upright counter-current chromatography and reversed-phase liquid chromatography[J]. J. Chromatogr. A, 2004, 1040:193-204.

[17]Scott I M, Puniani E, Jensen H, et al. Analysis of Piperaceae germplasm by HPLC and LC-MS: a method for isolating and identifying unsaturated amides from Piper extracts[J]. J. Agric. Food Chem., 2005, 53:1907-1913.

[18]Hashimoto K, Yaoi T, Koshiba H, et al. Phtotochemical isomerization of piperine, a pungent constituent in pepper[J]. Food Sci. Technol. Int. (Tokyo), 1996, 2:24-29.

[19]Marutolu C, Gogoasa I, Oprean I, et al. Separation and Identification of piperine and chavicine in black pepper by TLC and GC-MS[J]. J. Planar Chromatogr., 2006, 19:250-252.

[20]Nobuyuki K, Sukhyun C, Hyun C, et al. Kinetics of Light-induced cis-trans isomerization of four piperines and their levels in ground black peppers as determined by HPLC and LC/MS [J]. J. Agric. Food Chem., 2007, 55:7131-7139.

[21]Kozukue N，Park M S，Choi S H，et al. Kinetics of lightinduced cis-trans isomerization of four piperines and their levels in ground black pepper as determined by HPLC and LC/MS[J]. J Agric Food Chem, 2007, 55: 7131-7139.

[22]惠陽. 毛細管電泳在研究二苯乙烯類化合物的光誘導順反異構化反應及環境水樣中氨和烷基胺測定中的應用[M]. 蘭州:蘭州大學,2011.

Study on Light Induced Isomerization of Piperine Based on Capillary Electrophoresis*

HUI Yang, CHEN Wen-hao

(Key Laboratory of Tropical Medicinal Plant Chemistry of Ministry of Education, College ofChemistryandChemicalEngineering,HainanNormalUniversity,HainanHaikou571127,China)

High performance capillary electrophoresis platform based on the piperine in pepper photoinduced CIS trans isomerization reactions was researched, and several factors which may influence the effect of the reaction were sequentially investigated, the rate constant of reaction was calculated. Through experiments, the solution concentration of small light induced isomerization reacted more easily and effected by different wavelength of light source, the light source can be found only greater than the reactant itself the maximum absorption wavelength of light induced isomerization reaction induced by prolonged exposure time, also to a certain extent, the light induced isomerization reaction was more complete. And once to reach equilibrium, then the reactants will no longer reduce, the corresponding products will no longer increase. It was also worth noting that with acetone solvent. The reaction was found to have a certain degree of inhibition on the photo induced isomerization reaction, because the structure of the solvent was able to absorb UV light, and the reaction rate constantkwas calculated to be 0.077 min-1.

light induced isomerization; capillary electrophoresis; piperine

海南省自然科學基金(214030);海南省高等學校科學研究項目(HNKY2014-40);海南省高等學校教育教學改革研究項目(Hnjg2015-40)。

惠陽(1982-),女，蘭州大學博士學位，副教授,主要從事高效毛細管電泳的理論及應用等研究工作。

陳文豪，男，博士，副教授,主要從事天然產物及植物藥的分析研究工作。

O657

A

1001-9677(2016)09-0056-04