5-Aza-dC、TSA腹腔注射治療小鼠子宮內膜異位癥療效觀察

沈芳華，呂弘道，高紅，徐彩英，王利明，顧蓮萍

(1南通大學附屬吳江醫(yī)院，江蘇蘇州215200；2蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院)

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5-Aza-dC、TSA腹腔注射治療小鼠子宮內膜異位癥療效觀察

沈芳華1，2，呂弘道1，2，高紅1，2，徐彩英1，2，王利明1，2，顧蓮萍1，2

(1南通大學附屬吳江醫(yī)院，江蘇蘇州215200；2蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院)

目的觀察5′-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-dC)、曲古抑菌素A(TSA)腹腔注射治療小鼠子宮內膜異位癥(內異癥)的療效。方法取35只BALB/c小鼠，將子宮片段分別縫于雙側腹膜、雙角子宮起始處及腸系膜處制作內異癥模型。建模3周后分為4組，5-Aza-dC組腹腔注射5-Aza-dC 0.5 mg/(kg·d)，TSA組腹腔注射TSA 0.5 mg/(kg·d)，達那唑組給予達那唑110 mg/(kg·d)灌胃，模型對照組腹腔注射等量生理鹽水。分別于給藥前及給藥3周測算各組異位內膜病灶體積。8只小鼠正常飼養(yǎng)，設為正常對照組，采用醋酸扭體實驗評估各組小鼠給藥1、3周時的疼痛反應。結果5-Aza-dC組、TSA組及達那唑組給藥3周時異位內膜病灶體積較給藥前明顯縮小(P均<0.01)。模型對照組與正常對照組相比，疼痛反應時間縮短、扭體次數(shù)增加(P均<0.01)；5-Aza-dC組、TSA組組內不同給藥時間的疼痛反應時間、扭體次數(shù)相比，P均<0.05；5-Aza-dC組、TSA組疼痛反應時間較模型對照組延長、扭體次數(shù)減少(P均<0.05)。結論5-Aza-dC、TSA治療小鼠內異癥有效，可減小異位病灶體積，同時減輕疼痛。

子宮內膜異位癥；5′-氮雜-2′-脫氧胞苷；曲古抑菌素A；動物實驗

子宮內膜異位癥(以下簡稱內異癥)是一種婦科常見病，至今尚無根治藥物。多項研究[1，2]發(fā)現(xiàn)，內異癥可能是一種表觀遺傳學疾病。DNA甲基化及組蛋白去乙酰化是表觀遺傳學改變的重要表現(xiàn)方式，這些過程可逆。5′-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-dC)是一種嘧啶類去甲基化藥物。曲古抑菌素A(TSA)是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑。有學者[3～6]通過體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，5-Aza-dC、TSA可通過多種機制抑制異位內膜細胞增殖并誘導其凋亡。2014年10月～2015年2月，我們制作了小鼠內異癥模型，觀察了5-Aza-dC、TSA治療內異癥的效果，現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物與材料健康、雌性、未孕、6～8周齡BALB/c小鼠45只(上海動物實驗研究所提供)，體質量20～24.2 g，飼以高壓滅菌飼料及無菌水，實驗前在飼養(yǎng)室飼養(yǎng)2周以適應環(huán)境。5-Aza-dC，TSA，苯甲酸雌二醇，達那唑，戊巴比妥鈉，青霉素，冰醋酸，相差顯微鏡(型號Olympus CKX41)。

1.2內異癥小鼠模型制作取35只BALB/c小鼠，戊巴比妥鈉80 mg/kg腹腔注射麻醉，將小鼠左側子宮卵巢端及陰道端兩側結扎，剪下左側子宮，縱剖及橫斷成4個片段，分別縫于雙側腹膜、雙角子宮起始的“V”形處及腸系膜處。術后1～3 d肌注青霉素170萬U/(kg·d)，分別于術后第2、5、8、11天肌注苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg促進異位內膜生長。建模第3周末，剖腹探查異位內膜生長情況，以移植物體積增大呈透明結節(jié)狀或囊狀、內有液體集聚、表面有結締組織覆蓋及血管形成視為建模成功。取部分組織做病理檢查證實。

1.3動物分組與5-Aza-dC、TSA用法將建模成功的32只小鼠隨機分為4組，每組8只。5-Aza-dC組腹腔注射5-Aza-dC 0.5 mg/(kg·d)[7]；TSA組腹腔注射TSA 0.5 mg/(kg·d)；達那唑組以達那唑110 mg/(kg·d)灌胃；模型對照組腹腔注射等量生理鹽水。

1.4異位病灶體積測算分別于給藥前及給藥3周時測量各組小鼠異位內膜病灶的長、寬、高并以長×寬×高計算病灶體積，每只小鼠取四個病灶的均值。同時收集異位內膜組織，室溫固定24 h，脫水后石蠟包埋，做5 μm厚切片，進行HE染色，顯微鏡下觀察病理變化。

1.5小鼠疼痛反應觀察分別于給藥1、3周時進行醋酸扭體實驗。各組小鼠腹腔注射0.6%醋酸0.2 mL/只，用秒表記錄小鼠出現(xiàn)疼痛反應時間及20 min內的扭體次數(shù)。另取正常飼養(yǎng)的8只小鼠設為正常對照組，與各建模組同時進行醋酸扭體實驗。

2　結果

2.1各組小鼠給藥前后異位病灶體積比較5-Aza-dC組給藥前及給藥3周時異位病灶體積分別為(69.25±25.19)、(13.91±16.09)mm3，TSA組分別為(60.19±22.38)、(14.20±19.44)mm3，達那唑組分別為(68.25±13.13)、(24.06±9.28)mm3，模型對照組分別為(68.63±16.53)、(67.13±26.56)mm3。5-Aza-dC組、TSA組及達那唑組給藥前后異位病灶體積相比，P均<0.01；5-Aza-dC組、TSA組及達那唑組給藥3周時異位病灶體積相比，P均>0.05。

2.2各組小鼠疼痛反應比較模型對照組與正常對照組相比，疼痛反應時間縮短，扭體次數(shù)增加(P均<0.01)；5-Aza-dC組、TSA組組內不同給藥時間的疼痛反應時間、扭體次數(shù)相比，P均<0.05；5-Aza-dC組、TSA組疼痛反應時間較模型對照組延長、扭體次數(shù)減少(P均<0.05)。見表1。

表1　各組小鼠疼痛反應時間及扭體次數(shù)比較±s)

注：與同組給藥1周時相比，*P<0.05；與正常對照組相比，#P<0.01；與模型對照組相比，△P<0.05。

3　討論

內異癥的現(xiàn)有藥物治療方案如孕激素、雄激素及促性腺激素釋放激素激動劑等均只能暫時緩解癥狀，無法達到根治，手術治療后復發(fā)率也很高，所以，新的治療方式正在不斷探索中。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學改變在內異癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。表觀遺傳學改變主要表現(xiàn)為DNA甲基化修飾和組蛋白的去乙酰化修飾等[8，9]。有學者[2，10]發(fā)現(xiàn)，內異癥患者的許多基因均存在表觀遺傳學改變，此過程可逆，如采用甲基轉移酶抑制劑或去乙酰化酶抑制劑，有望從基因水平逆轉疾病進展，進行基因靶向治療[11]。

5-Aza-dC是一種嘧啶類去甲基化藥物。TSA為組蛋白去乙酰化酶抑制劑。研究[12]發(fā)現(xiàn)，5-Aza-dC在體外可通過不同途徑抑制多種腫瘤細胞增殖，而且，5-Aza-dC在復發(fā)性、頑固性白血病和慢性髓性白血病危象治療方面已進入Ⅲ期臨床試驗。TSA也可抑制多種腫瘤細胞生長，如白血病細胞、肝癌細胞、胃癌細胞等[13]。體外實驗中已發(fā)現(xiàn)5-Aza-dC 、TSA可明顯抑制異位內膜生長[3～6，14]，這為內異癥的治療提供了一條全新途徑。有學者[15]發(fā)現(xiàn)TSA可抑制小鼠異位病灶生長，下調異位病灶中痛覺相關基因瞬時受體電位香草酸亞型1(TRPV1)的表達。本實驗建立了小鼠內異癥模型，并給予5-Aza-dC、TSA、達那唑，發(fā)現(xiàn)5-Aza-dC組、TSA組、達那唑組內異癥病灶體積較模型對照組明顯縮小，可見5-Aza-dC及TSA治療內異癥有一定效果。

內異癥是一種疼痛相關疾病，該病最主要的臨床表現(xiàn)為疼痛，包括痛經、慢性盆腔痛、性交痛等。有學者[16]發(fā)現(xiàn)內異癥患者痛閾較正常人群降低。小鼠醋酸扭體實驗是常用的鎮(zhèn)痛藥篩選方法。我們通過醋酸扭體實驗發(fā)現(xiàn)，模型對照組與正常對照組相比，疼痛反應時間有所縮短、扭體次數(shù)增加，提示內異癥小鼠痛閾較正常小鼠有所降低，這與He等[16]的研究結論一致。5-Aza-dC組及TSA組與模型對照組相比，疼痛反應時間延長、扭體次數(shù)減少，表明5-Aza-dC、TSA有一定的鎮(zhèn)痛作用。

總之，我們認為，5-Aza-dC、TSA治療小鼠內異癥有效，可減小異位病灶體積，同時減輕疼痛，5-Aza-dC、TSA有望成為治療內異癥新的藥物，但兩藥的具體作用機制和不良反應仍需進一步研究。

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2015-10-10)