轉(zhuǎn)染Elf5基因的人卵巢癌干細(xì)胞增殖、侵襲能力及凋亡變化

仇影影，謝肖磊，邱玲琳，閆洪超

(1徐州醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，江蘇徐州221002；2徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

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·基礎(chǔ)研究·

轉(zhuǎn)染Elf5基因的人卵巢癌干細(xì)胞增殖、侵襲能力及凋亡變化

仇影影1，謝肖磊1，邱玲琳1，閆洪超2

(1徐州醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，江蘇徐州221002；2徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

目的觀察轉(zhuǎn)染Elf5基因的人卵巢癌干細(xì)胞增殖、侵襲能力及凋亡變化。方法將目的基因Elf5+EGFP克隆到載體pcDNA3.1中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Elf5+EGFP，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆菌落，大量抽提質(zhì)粒。培養(yǎng)人卵巢癌干細(xì)胞并分為重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組、空白對(duì)照組。重組質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Elf5+EGFP真核表達(dá)載體，空質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP空載質(zhì)粒，空白對(duì)照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用Western blotting法檢測(cè)Elf5蛋白。分別于轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5、6 d采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；轉(zhuǎn)染24 h后采用侵襲小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力并計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)；轉(zhuǎn)染24 h后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同周期細(xì)胞及凋亡細(xì)胞。結(jié)果成功構(gòu)建了pcDNA3.1-Elf5+EGFP真核細(xì)胞表達(dá)載體，重組質(zhì)粒組細(xì)胞中Elf5蛋白穩(wěn)定表達(dá)。轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5、6 d重組質(zhì)粒組細(xì)胞增殖能力低于空白對(duì)照組和空質(zhì)粒組(P均<0.05)。重組質(zhì)粒組穿膜細(xì)胞數(shù)少于空質(zhì)粒組、空白對(duì)照組(P均<0.05)。重組質(zhì)粒組G0/G1期細(xì)胞百分比高于空質(zhì)粒組、空白對(duì)照組(P均<0.05)。重組質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率高于空質(zhì)粒組、空白對(duì)照組(P均<0.05)。結(jié)論轉(zhuǎn)染ELF5基因的人卵巢癌干細(xì)胞增殖、侵襲能力受到抑制，細(xì)胞凋亡增多。

Elf5基因；卵巢癌；腫瘤干細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中，卵巢癌惡性程度最高，病死率居于首位[1]。卵巢癌之所以易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，根本原因在于腫瘤干細(xì)胞[2～4]。我們前期研究篩選出具有腫瘤干細(xì)胞特征的卵巢癌干細(xì)胞(以人HO8910細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)對(duì)象)，經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)篩選出的細(xì)胞具有較強(qiáng)的分化、自我更新能力，并有多藥耐藥性較高的干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)水平和體內(nèi)成瘤特性[5]。Elf5是Ets基因家族成員之一，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[6,7]。Elf5與卵巢癌干細(xì)胞的關(guān)系目前尚未見(jiàn)報(bào)道，為此，2015年1～10月，我們觀察了轉(zhuǎn)染Elf5基因的人卵巢癌干細(xì)胞增殖、侵襲能力及凋亡的變化，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料DNA內(nèi)切酶、DNA連接酶及DNA marker購(gòu)自Fermentas公司；DNA凝膠回收試劑盒及瓊脂糖購(gòu)自天根生化科技有限公司；中量抽提試劑盒購(gòu)自杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；無(wú)乙水醇、異丙醇、丙三醇及無(wú)水氯化鈣購(gòu)自北京國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；人卵巢癌干細(xì)胞由本課題組保存；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司； Liptapfector脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；Elf5一抗及Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司；大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2pcDNA3.1- Elf5+EGFP載體的構(gòu)建及鑒定目的基因上下游引物分別加BamHⅠ、EcoRⅠ及保護(hù)堿基，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成引物，將oligo溶解成50 μmol/L，進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)，利用Agarose電泳并切膠回收Elf5+EGFP基因片段。用BamHⅠ和EcoRⅠ分別對(duì)Elf5+EGFP基因片段和載體pcDNA3.1進(jìn)行酶切，用DNA凝膠回收試劑盒回收。用T4DNA ligase連接雙酶切，得到Elf5+EGFP基因片段和線性化載體。氯化鈣法制備感受態(tài)細(xì)胞，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，從平板上鑒定并挑選陽(yáng)性克隆菌落，置于含LB培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)。抽提菌液質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與目的基因序列比對(duì)無(wú)誤后，將菌液接種于LB培養(yǎng)基，進(jìn)行質(zhì)粒抽提，獲得足夠的重組質(zhì)粒。

1.3細(xì)胞分組與Elf5基因轉(zhuǎn)染人卵巢癌干細(xì)胞用含EGF、bFGF、Noggi、LIF的培養(yǎng)基培養(yǎng)，分為重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組、空白對(duì)照組。重組質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1- Elf5+EGFP真核表達(dá)載體，空質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP空載質(zhì)粒，空白對(duì)照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染結(jié)束后，用G418培養(yǎng)基對(duì)已轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行篩選并傳代培養(yǎng)。Western blotting法檢測(cè)Elf5蛋白。

1.4細(xì)胞增殖能力觀察將三組細(xì)胞按1.5×104/孔分別接種于96孔培養(yǎng)板，分別于轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5、6 d后加入MTT工作液，繼續(xù)培養(yǎng)，最后加入二甲基亞砜終止反應(yīng)。將96孔培養(yǎng)板置于BOIBASE2000全自動(dòng)酶標(biāo)儀上，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值(A值)，代表細(xì)胞增殖能力。

1.5細(xì)胞侵襲能力觀察轉(zhuǎn)染24 h后采用侵襲小室檢測(cè)卵巢癌干細(xì)胞的體外侵襲能力。分離并提取各組細(xì)胞懸液，以105/孔將細(xì)胞接種于侵襲膜上并培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后去除膜上基質(zhì)膠及殘留細(xì)胞，固定并進(jìn)行染色，倒置顯微鏡下觀察并計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)，反映細(xì)胞侵襲能力。

1.6不同周期細(xì)胞檢測(cè)轉(zhuǎn)染24 h后胰酶消化、洗滌并離心細(xì)胞，固定細(xì)胞，加100 μL PBS并吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度，用流式細(xì)胞儀分析不同周期細(xì)胞分布情況。

1.7凋亡細(xì)胞檢測(cè)轉(zhuǎn)染24 h后胰酶消化、洗滌并離心細(xì)胞，固定細(xì)胞，加100 μL PBS并吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按annexin V-PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)算細(xì)胞凋亡率。

2　結(jié)果

2.1pcDNA3.1- Elf5+EGFP載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染情況酶切結(jié)果顯示，在1 518 bp位置出現(xiàn)明顯條帶，與預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小相符，對(duì)照組未擴(kuò)增出條帶；DNA序列分析結(jié)果顯示，目的基因序列與GenBank中基因序列完全相同，目的基因插入方向正確，證實(shí)重組質(zhì)粒pcDNA3.1- Elf5+EGFP構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，細(xì)胞中Elf5蛋白表達(dá)上調(diào)，而空質(zhì)粒組及空白對(duì)照組未檢測(cè)到Elf5蛋白表達(dá)。

2.2各組細(xì)胞增殖能力比較轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5、6 d重組質(zhì)粒組A值低于空白對(duì)照組和空質(zhì)粒組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間A值比較

注：與重組質(zhì)粒組相比，*P<0.05。

2.3各組細(xì)胞侵襲能力比較重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組、空白對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(92.1±2.7)、(149.6±4.6)、(147.4±5.3)個(gè)，重組質(zhì)粒組與空質(zhì)粒組、空白對(duì)照組相比，P均<0.05。

2.4各組不同周期細(xì)胞分布比較重組質(zhì)粒組G0/G1期細(xì)胞百分比高于空質(zhì)粒組、空白對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　各組不同周期細(xì)胞分布比較±s)

注：與重組質(zhì)粒組相比，*P<0.05。

2.5各組細(xì)胞凋亡率比較重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組、空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為31.4%±1.9%、9.1%±2.2%、8.7%±1.5%，重組質(zhì)粒組與空質(zhì)粒組、空白對(duì)照組相比，P均<0.05。

3　討論

目前研究[8,9]表明，卵巢癌發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)與卵巢癌干細(xì)胞的無(wú)限增殖、自我更新和多向分化能力有密切關(guān)系。Ets家族成員在正常細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]。Elf5屬于其成員之一，位于人類染色體11q13～15，此區(qū)域與其他脆性位點(diǎn)一樣，易出現(xiàn)雜合性缺失。Elf5的完整結(jié)構(gòu)域包含參與蛋白間相互作用的結(jié)構(gòu)域、與蘇氨酸/半胱氨酸核心序列結(jié)合的基序及兩個(gè)共性結(jié)構(gòu)域[6]。Elf5基因在胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞、上皮外分泌腺和人類乳腺等器官中均有表達(dá)，但表達(dá)程度各不相同[11～15]。正常情況下，Elf5不僅可調(diào)節(jié)腺泡細(xì)胞的產(chǎn)生，還可影響胚胎發(fā)育[16]。有學(xué)者[17]研究表明，Elf5基因的雜合性缺失可導(dǎo)致乳腺成體干細(xì)胞增加，促進(jìn)乳腺癌發(fā)病。近年來(lái)國(guó)外眾多學(xué)者[18～20]也認(rèn)為Elf5是乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的潛在抑癌基因，有望成為乳腺癌新的治療靶點(diǎn)。關(guān)于Elf5基因?qū)θ寺殉舶└杉?xì)胞生物學(xué)行為的影響，目前報(bào)道較少。

本研究首先成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pcDNA3.1- Elf5+EGFP，并將其成功轉(zhuǎn)染人卵巢癌干細(xì)胞，然后從多方面研究了Elf5在體外的一系列生物學(xué)作用。我們發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒組細(xì)胞增殖能力低于空質(zhì)粒組及空白對(duì)照組，表明Elf5基因?qū)β殉舶└杉?xì)胞增殖具有明顯抑制及延緩作用。重組質(zhì)粒組G0/G1期細(xì)胞百分比高于空質(zhì)粒組、空白對(duì)照組，提示Elf5基因可抑制G0/G1期進(jìn)展到S期、G2/M期，進(jìn)一步推測(cè)Elf5基因?qū)β殉舶└杉?xì)胞的增殖抑制作用可能與干擾細(xì)胞周期有關(guān)。侵襲小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒組的穿膜細(xì)胞數(shù)少于空質(zhì)粒組及空白對(duì)照組，表明Elf5基因可限制卵巢癌干細(xì)胞的侵襲及運(yùn)動(dòng)能力。本研究結(jié)果還顯示，重組質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率高于其余兩組，提示Elf5基因不僅能抑制卵巢癌干細(xì)胞增殖，還可促進(jìn)其凋亡。但對(duì)于Elf5基因通過(guò)何種機(jī)制影響卵巢癌干細(xì)胞的生物學(xué)行為，目前尚處于初級(jí)研究階段。在以后的研究中，我們還將進(jìn)一步探索Elf5基因的具體作用機(jī)制。

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閆洪超(E-mail：1015058194@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.19.008

R737.31

A

1002-266X(2016)19-0025-03

2015-12-04)