曲古抑菌素A對卵巢癌細胞分化、增殖的影響及其機制

賴文升，史紫君，萬曉蕾，薛晶，邵根寶，鄒圣強

(1江蘇大學醫學院，江蘇鎮江212013；2江蘇大學附屬鎮江三院)

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曲古抑菌素A對卵巢癌細胞分化、增殖的影響及其機制

賴文升1，史紫君1，萬曉蕾1，薛晶1，邵根寶1，鄒圣強2

(1江蘇大學醫學院，江蘇鎮江212013；2江蘇大學附屬鎮江三院)

目的觀察曲古抑菌素A(TSA)對卵巢癌細胞分化、增殖及細胞周期的影響，并探討其機制。方法培養卵巢癌上皮細胞系HO8910，將細胞分為A、B、C、D組，分別加入0、100、200、400 nmol/L TSA。分別于培養24、48、72 h觀察A、C組細胞形態變化；于培養24 h后采用Western blotting法檢測四組細胞中的Y染色體上的性別決定區盒2(SOX-2)、八聚體結合轉錄因子4(OCT-4)和叉頭樣轉錄因子A2(FOXA-2)。分別采用MTT法及EdU染色法檢測細胞增殖能力，流式細胞術檢測不同周期細胞。采用Western blotting法檢測各組細胞中的Cyclin D1和p21Cip1蛋白。結果A組細胞多為類圓形或橢圓形，外表規整，成簇生長。C組細胞發生形態轉變，細胞密度有所下降。與A組相比，B、C、D組細胞中SOX-2、OCT-4表達下調，FOXA-2表達升高(P均<0.05)。與A組相比，B、C、D組細胞增殖率降低，G0/G1期細胞比例增高，S期細胞比例減小，Cyclin D1蛋白表達下調，p21Cip1蛋白表達上調(P均<0.05)。結論TSA可誘導卵巢癌HO8910細胞分化，抑制細胞增殖，其機制可能與調節細胞分化相關蛋白及細胞周期相關蛋白表達有關。

曲古抑菌素A；卵巢癌；細胞分化；細胞增殖；Y染色體上的性別決定區盒2;八聚體結合轉錄因子4；叉頭樣轉錄因子A2；細胞周期蛋白D1；細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑

上皮性卵巢癌(EOC)是最常見的婦科惡性腫瘤之一[1]，70%的患者接受一線化療后18個月內復發[2,3]，晚期患者5年生存率較低(僅為30.6%)[4]，因此迫切需要制定有效的化療策略。分化治療作為一種新的化療策略，通過藥物誘導惡性腫瘤細胞分化成非惡性細胞甚至正常細胞，具有巨大的潛力[5～7]。組蛋白乙酰化修飾和去乙酰化修飾是表觀遺傳調控的重要組成部分。組蛋白乙酰轉移酶(HAT)和去乙酰化酶(HDAC)活性失衡將導致細胞周期、分化和凋亡等相關基因異常轉錄[8]，而HDAC抑制劑能夠逆轉這一作用，并促進細胞分化。曲古抑菌素A(TSA)是近年來備受關注的一種異羥肟酸型HDAC抑制劑。關于TSA與卵巢癌的關系研究主要集中在TSA的促凋亡和抑制遷移作用，但對TSA的促分化作用較少涉及。本研究觀察了TSA對卵巢癌細胞分化、增殖及細胞周期的影響，并探討其機制，為卵巢癌的分化治療提供理論依據。

1　材料與方法

1.1細胞培養與分組卵巢癌細胞系HO8910由江蘇大學邵啟祥教授實驗室贈予，培養于含有10% FBS和抗生素(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/mL)的DMEM中，并置于37 ℃、5% CO2培養箱。當細胞融合度至80%時，以2×105/mL接種于培養皿中培養過夜。將細胞分為A、B、C、D四組，分別加入0、100、200、400 nmol/L TSA。

1.2細胞形態觀察分別于培養24、48、72 h用倒置顯微鏡觀察A、C組細胞形態并用CCD相機拍照。

1.3細胞分化相關蛋白檢測四組培養24 h后，采用Western blotting法檢測分化相關蛋白Y染色體上的性別決定區盒2(SOX-2)、八聚體結合轉錄因子4(OCT-4)和叉頭樣轉錄因子A2(FOXA-2)。提取各組細胞總蛋白，經8%～12% SDS-PAGE凝膠分離和電轉移至PVDF膜，轉膜后由含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，一抗孵育液4 ℃過夜，TBST洗膜3次，二抗室溫孵育1 h，再用TBST洗膜3次，最后用ECL曝光液在化學發光檢測器中曝光并拍照。用Image Pro Plus軟件測定條帶灰度值，然后計算目的蛋白條帶灰度值與內參照條帶灰度值的比值，表示蛋白相對表達量。

1.4細胞增殖能力檢測①MTT法：四組分別于培養24、48、72 h，將20 μL的MTT加入到96孔板中，4 h后吸除培養基，加入150 μL DMSO，在搖床上搖15 min以溶解甲臜，用酶標儀測定490 nm波長處光密度值(OD值)。細胞增殖率=OD實驗組/OD對照組×100%。②EdU法：取A、C組細胞，培養48 h后將50 mmol/L EdU添加到培養基中，孵育2 h，再加入DAPI進行細胞核染色，由奧林巴斯激光掃描顯微鏡系統拍攝照片；照片中綠色熒光為正在進行DNA復制的細胞核，對綠色熒光細胞核進行計數。

1.5不同周期細胞檢測四組培養48 h后，胰酶消化細胞，PBS洗滌2遍，將細胞與DNA結合染料PI(50 g/mL)和RNase(1 mg/mL)在37 ℃恒溫箱中避光孵育30 min，采用流式細胞儀分析。

1.6細胞周期相關蛋白檢測各組細胞培養48 h后，采用Western blotting法檢測G1細胞周期調控蛋白Cyclin D1和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21Cip1。方法參考“1.2.2”。

2　結果

2.1各組細胞形態改變A組細胞多為類圓形或橢圓形，外表規整，成簇生長。C組細胞發生類圓形—星狀—梭形轉變，細胞密度也有所下降。詳見圖1。

圖1　A、C組不同培養時間細胞形態學變化(100×)

2.2各組細胞分化相關蛋白表達比較Western blotting檢測顯示，TSA明顯下調SOX-2和OCT-4的蛋白表達水平，而誘導FOXA-2表達上調，且呈濃度依賴性。詳見表1。

表1　各組細胞中SOX-2、OCT-4、FOXA2表達比較

注：與A組相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.3各組細胞增殖率比較MTT結果顯示，B、C、D組細胞增殖率低于A組，且隨著TSA作用濃度增大、時間延長，細胞增殖率逐漸降低(P均<0.05)。見表2。EdU染色結果顯示，C組綠色熒光細胞核數較A組減少(見圖2)。說明TSA可抑制HO8910細胞增殖，而非誘導細胞凋亡。

表2　各組細胞增殖率比較

注：與A組相比，*P<0.05，**P<0.01。

注：A為A組；C為C組。

圖2 EdU染色后A、C組細胞增殖情況

2.4各組不同周期細胞分布比較與A組相比，B、C、D組G0/G1期細胞比例增高，S期細胞比例減小(P均<0.01)。見表3。

表3　各組不同周期細胞分布比較±s)

注：與A組相比，*P<0.01。

2.5各組細胞周期相關蛋白表達比較A、B、C、D組p21Cip1蛋白相對表達量分別為0.12±0.01、0.13±0.01、0.22±0.03、0.36±0.01，Cyclin D1蛋白相對表達量分別為0.68±0.04、0.47±0.05、0.21±0.02、0.16±0.01。與A組相比，B、C、D組細胞Cyclin D1蛋白表達下調，p21Cip1蛋白表達上調(P均<0.05)。

3　討論

與基因突變或缺失相比，表觀遺傳修飾是可逆的，并不引起基因序列變化，因此成為化療相關研究的熱點[9]。HDAC抑制劑可通過上調組蛋白乙酰化水平從而誘導細胞發生分化和(或)凋亡[10]。現已證明許多HDAC抑制劑具有誘導細胞分化的能力[11]。我們利用人類卵巢癌細胞系HO8910研究TSA對惡性腫瘤細胞分化的作用，結果顯示，A組細胞多為類圓形或橢圓形，外表規整，成簇生長；C組細胞發生類圓形—星狀—梭形轉變，細胞密度也有所下降，提示TSA可誘導HO8910細胞發生形態變化。

卵巢癌患者預后差的一部分原因可能是腫瘤干細胞的存在[12]。腫瘤干細胞具有自我更新和分化能力，在腫瘤發生、化療耐藥、腫瘤復發和轉移過程中發揮重要作用[12,13]。SOX-2、OCT-4、FOXA-2等轉錄因子可協同調節干細胞自我更新和分化所需的基因及信號通路。據報道，SOX-2高表達可阻止人多能性NT2/D1細胞向神經元或向膠質細胞分化，成熟神經元中SOX-2的表達水平較低[14]。OCT-4表達上調也與某些低分化的惡性腫瘤有關。FOXA-2高表達則可通過提高組蛋白H3乙酰化水平從而誘導干細胞向多巴胺能神經元分化[15]。與高分化腫瘤相比，低分化腫瘤組織中更易檢測到高度表達的SOX-2、OCT-4蛋白，后兩者在癌旁組織及良性腫瘤組織中不表達[16]。本研究將SOX-2、OCT-4和FOXA-2作為反映卵巢癌細胞分化程度的指標，結果顯示，與A組相比，B、C、D組SOX-2、OCT-4蛋白表達下調，FOXA-2蛋白表達增高，提示TSA可通過調節細胞分化相關基因表達誘導卵巢癌細胞分化，即下調SOX-2、OCT-4蛋白表達，上調FOXA-2蛋白表達。推測TSA可抑制HDAC活性，通過提高組蛋白乙酰化水平破壞電荷平衡狀態，從而打開DNA雙鏈，促進細胞譜系特異性基因的轉錄激活。具體機制仍需進一步研究。

細胞增殖與分化是由細胞周期中的G1期或G1/S期所控制的[17～19]。目前已知HDAC抑制劑誘導分化常伴隨特定基因表達水平改變，如p21Cip1、Cyclin D1。這些基因表達水平改變可導致細胞增殖抑制和細胞周期阻滯。在參與G1期調控的細胞周期蛋白中，Cyclin D1與腫瘤發生關系最密切。Cyclin D1與CDK4的結合為G1期向S期過渡所必需，CDK抑制劑p21Cip1是細胞周期進程中的負性調節因子，可抑制G1期向S期過渡。本研究結果顯示，與A組相比，B、C、D組細胞增殖率降低，G0/G1期細胞比例增高，S期細胞比例減小，Cyclin D1蛋白表達下調，p21Cip1蛋白表達上調，提示TSA能誘導細胞增殖抑制并使細胞周期阻滯，可能通過調控p21Cip1和Cyclin D1表達發揮上述作用。

綜上所述，TSA可誘導卵巢癌細胞分化，抑制細胞增殖，其機制可能與調節細胞分化相關蛋白及細胞周期相關蛋白表達有關。

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Effect of TSA on differentiation and proliferation of ovarian cancer cells and its mechanism

LAI Wensheng1,SHI zijun,WAN Xiaolei,XUE Jing,SHAO Genbao,ZOU Shengqiang

(1 Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

ObjectiveTo observe the effect of trichostatin A (TSA) on the differentiation,proliferation and cell cycle of ovarian cancer cells and to investigate its mechanism.MethodsEpithelial ovarian cancer cell line HO8910 was cultured and divided into groups A,B,C and D,respectively,which were added with 0,100,200 and 400 nmol/L TSA.Cell morphology of groups A and C were observed at 24 h,48 h and 72 h after culture.The expression of sex-determining region Y chromosome cassette-2 (SOX-2),octamer binding transcription factor 4 (OCT-4) and fork-like transcription factor A2 (FOXA2) in the four groups was detected by using Western blotting 24 hours after culture.The cell proliferation was detected by MTT and EdU staining,distribution of cell cycle was detected by flow cytometry and the expression of Cyclin D1 and p21Cip1protein was detected by Western blotting.ResultsCells in the group A were mostly round or oval,looked neat and grew in clusters.While cell morphology in the group C changed and cell density decreased.Compared with group A,the expression of SOX-2 and OCT-4 in the groups B,C and D were decreased,FOXA-2 expression was increased (all P<0.05).Compared with group A,the cell proliferation rates were decreased,the proportion of cells in G0/G1phase was increased,the proportion of cells in S phase was decreased,the expression of Cyclin D1 was decreased and the expression of p21Cip1protein in the groups B,C and D was increased (all P<0.05).ConclusionTSA can induce ovarian cancer cell differentiation and inhibit the cell proliferation,which may be related to the regulation of cell differentiation-related and cell cycle-related proteins.

trichostatin A; ovarian carcinoma; cell differentiation,cell proliferation; sex-determining region Y chromosome cassette-2; octamer binding transcription factor 4; fork-like transcription factor A2; Cyclin D1; cyclin-dependent kinase inhibitor

國家自然科學基金資助項目(81170573)。

賴文升(1986-)，男，在讀研究生，主要研究方向為腫瘤學。E-mail：405560193@qq.com

簡介：鄒圣強(1968-)，男，主任醫師，主要研究方向為重癥醫學。E-mail：1210xyz@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.19.003

R737.31

A

1002-266X(2016)19-0008-04

2015-11-25)