清肺理痰方對急性肺損傷大鼠肺組織NF-κB 和Toll樣受體4表達的影響*

王　凱　潘俊輝　王　鵬（廣州醫科大學附屬第一醫院，廣東 廣州 510120）

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清肺理痰方對急性肺損傷大鼠肺組織NF-κB 和Toll樣受體4表達的影響*

王凱潘俊輝△王鵬
（廣州醫科大學附屬第一醫院，廣東 廣州 510120）

目的 研究清肺理痰方對脂多糖（LPS）誘導的急性肺損傷（ALI）大鼠肺組織NF-κB和Toll樣受體4表達的影響。方法 SD大鼠72只，隨機分為正常對照組、模型對照組，地塞米松組、清肺理痰方低、中、高劑量組，共6組，每組12只。各治療組大鼠按試驗劑量給予相應濃度的藥液，每日1次，連續7 d。末次給藥1 h后，模型組與各治療組大鼠采用氣管內每只注射0.2 mL mg/mL的脂多糖溶液復制急性肺損傷模。24 h后取肺組織進行HE染色觀察肺組織病理變化，采用ELISA法檢測大鼠血清IFN-γ濃度，用Western Blot法和qRT-PCR法測定大鼠肺組織NF-κB p65和TLR4蛋白和mRNA的表達。結果 與正常對照組比較，模型對照組大鼠肺組織呈現明顯的肺組織損傷，血清IFN-γ濃度上升，NF-κB p65和TLR4蛋白和mRNA的表達明顯升高（P<0.01）；與模型對照組比較，清肺理痰方低、中、高劑量組血清IFN-γ濃度下降，NF-κB P65和TLR4蛋白和mRNA的表達明顯降低（P<0.01），且中、高劑量組低于低劑量組。結論 清肺理痰方能改善內毒素誘導的急性肺損傷大鼠肺組織的損傷，對肺組織損傷有一定的保護作用，其機制可能與抑制肺組織NF-κB和TLR4 mRNA表達有關。

急性肺損傷清肺理痰方核轉錄因子-κBTLR4

【Abstract】Objective：To investigate the role of LPS（lipopolysaccharide）in acute lung injury（ALI）and protective effect of Qingfei Litan（QFLT）decoction.Methods：72 SD male rats were randomly divided into 6 groups：the normal control group，the model group，dexamethasone group and QFLT low-dose，middle-dose，high-dose group，12 rats in each group.The experiment lasted for 7 d.LPS（8 mg/mL）was injected into the trachea of rats to perform ALI model.The normal control group and the model group were given the same volume of physiological saline.After 24 hours，Western Blot and qRT-PCR were used to detect NF-κB andTLR4 mRNA and protein in lung tissue.The pathological manifestation of the lung was observed.Results：Compared with the normal group，the expressions of the levels of IFN-γ，NF-κB p65 and TLR4 mRNA and protein was significantly higher in QFLT group（P<0.01）；compared with the model group，the expressions of the levels of IFN-γ，NF-κB p65 and TLR4 mRNA and protein was significantly lower（P<0.01）.High dose group was lower than that of low dose group.Conclusion：Qingfei Litan decoction can less the injury of lung tissue and has protective effects on rats with ALI induced by LPS.The mechanism is possibly related to the inhibition of the expressions of NF-κB and TLR4 mRNA in injured lung tissues.

【Key words】Acute lung injury；QFLT decoction；NF-κB；Toll-like receptor 4

急性肺損傷（ALI）是肺部的全身炎癥反應表現，炎性介質調控失衡在ALI的發病過程中起重要作用，細胞因子則構成了ALI炎癥反應網絡。如何通過中醫藥的干預來調控ALI的分子機制已成為治療ALI的重要研究方向。

清肺理痰方源自國家中醫藥管理局 《風溫肺熱病中醫診療方案》［1-2］，在本課題前期的臨床研究中療效顯著［3］，并且本課題組在前期動物實驗中初步探討了其對NF-κB信號通路的蛋白表達的作用機制［4］。Toll樣受體4（TLR4）作為脂多糖（LPS）的重要受體［5］，通過刺激細胞內信號轉導通路影響ALI的表達機制，在前期研究基礎上，深入研究清肺理痰方對脂多糖內毒素誘導的急性肺損傷大鼠肺組織NF-κB和TLR4表達的影響，進一步明確ALI的發病機制，為中醫藥治療ALI提供新的分子治療靶點。現報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物

SPF級品系和級別：SPF級SD大鼠，雌雄各半，72只，200～220 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號為SCXK（粵）2013-0002，實驗動物質量合格證明編號為44007200019456、44007200021999，實驗證明編號為00110197、00114773；專用標準飼料、水喂養。

1.2藥物與試劑

清肺理痰方由青天葵10 g，石膏30 g，瓜蔞皮15 g，黃芩15 g，浙貝母 15 g，魚腥草20 g，蘆葦莖15 g，北杏仁10 g，桔梗15 g，甘草10 g組成，藥物飲片購于廣州醫科大學附屬第一醫院，實驗前由武漢康樂藥業有限公司制成中藥浸膏，4℃冰箱備用。地塞米松磷酸鈉注射液（天津金耀集團湖北天藥藥業股份有限公司，批號：51411032）；脂多糖內毒素 （Escherichia coli，055：B5，Sigma公司）；IFN-γ試劑盒（購于武漢華美生物工程有限公司，批號：J27013191）。一抗p65，一抗TLR4（生產商：abcam）；大鼠NF-κB、TLR4引物探針序列由廣州萊德爾生物科技有限公司合成。

1.3儀器

BS224S電子分析天平（感量0.0001g，德國Sartorius）、KDC-2046低速冷凍離心機（科大創新股份有限公司中佳分公司）、酶標儀（賽默飛世爾儀器有限公司，序列號：3530910449）、超聲儀細胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司，JY92-IIN）。

1.4分組與給藥

大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、地塞米松組及清肺理痰方低、中、組高劑量組，共6組，每組12只。根據人與動物藥物劑量換算公式［6］，經過提取后對應中藥浸膏每劑36.47 g，每只大鼠所對應的相對劑量為3.95 g/kg，再結合本課題前期動物實驗研究［4］，低劑量組3.95 g/kg體質量，中劑量組7.90 g/kg體質量，高劑量組15.80 g/kg體質量。第1～7日，清肺理痰方低、中、高劑量組動物分別灌胃給予相應的藥物，灌胃體積為12 mL/kg體質量，每日1次。第6、7日，地塞米松組動物腹腔注射地塞米松磷酸鈉注射液，每日1次，連續2 d，腹腔注射體積為1mL/kg體質量。

1.5模型制備

末次給藥1 h后，制作急性肺損傷模型［7-8］。經水合氯醛麻醉后，模型對照組、地塞米松組和低、中、高劑量組的動物分別用注射器經氣管注入8 mg/mL的脂多糖溶液，正常對照組注入等體積0.9%氯化鈉注射液，每只0.2 mL。

1.6標本采集與檢測

造模后24 h，動物3%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，約0.5 mL至EDTA-K2抗凝真空采血管，約4 mL至普通真空采血管，2500 r/min離心10 min，吸取上層血清分裝于2個EP管中，標記，-20℃保存，備用，ELISA法測定其IFN-γ含量。剪取左肺，計算濕/干重比；分離右肺上葉，用4%中性甲醛固定，待檢，用于病理檢測及肺組織NF-κB和TLR4 mRNA蛋白表達檢測；右肺下葉置于液氮罐中作NF-κB和TLR4 mRNA表達檢測。

1.6.1肺組織病理學觀察右上肺組織用4%中性甲醛固定，常規HE染色，光鏡下觀察組織變化。制作好的H.E染色切片置于光學顯微鏡下，從低倍到高倍，觀察SD大鼠肺組織有無肺水腫、肺出血、炎性細胞浸潤、肺泡壁增厚、小氣道損傷等病理改變。按程度積分總和，作為肺損傷程度積分，評分方法參照相關文獻［9］。

1.6.2血清IFN-γ檢測將以上裝有全血的促凝管靜置1 h，2500 r/min離心10 min，吸取上層血清分裝到EP管中-20℃凍存待測。ELISA雙抗體夾心法測定血清IFN-γ的含量，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6.3Western Blot法檢測肺組織中NF-κB p65和TLR4蛋白的表達采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法，使用BeyoECL Plus（P0018）等ECL類試劑來檢測肺組織中NF-κB p65和TLR4蛋白的表達，用FluorChemQ多功能成像和定量分析系統將膠片成像。

1.6.4實時熒光定量PCR法檢測肺組織中NF-κB p65和TLR4 mRNA的表達按美國Invitrogen公司Trizol試劑提取總RNA后，逆轉錄合成cDNA。12 μL反應體系中，10 mmol/L dNTP 1 μL，隨機引物1 μL，標本RNA 2 μg，混勻后于65℃5 min，快速插入冰水中，離心，冰上加入：5×buffer 4 μL，DTT（100 mmol/L）2 μL，RNAsin（40 U/μL）1 μL，M-MLVRT反轉錄酶（200 U/μL）1 μL，37℃50 min，70℃15 min，-20℃保存。PCR擴增：Sybr green 10 μL，上游引物（5 μmol/L）2 μL，下游引物（5 μmol/L）2 μL，反轉錄產物2 μL，擴增條件：1）95℃10 s；2）95℃5 s，60℃20 S，40個循環。

1.7統計學處理

2　結　果

2.1各組大鼠肺組織病理學形態觀察及肺損傷指數光鏡觀察：正常對照組肺泡結構清晰，肺泡壁薄，肺間質無炎細胞浸潤，肺泡內未見水腫液和肺出血。模型對照組各級支氣管黏膜上皮細胞部分變性、脫落，間隔增厚，間隔內及肺泡腔明顯中性粒細胞浸潤。地塞米松組見上皮細胞部分變性、脫落，肺泡間隔輕度增厚，中性粒細胞明顯浸潤。清肺理痰方各組大鼠肺組織病理改變輕于模型組，肺泡間間隔增厚，中性粒細胞浸潤減輕，未見肺水腫和肺出血（見圖1）。肺損傷的輕重程度評分：與正常對照組比較，模型對照組肺損傷的評分明顯升高（P<0.05）。與模型對照組比較，地塞米松組和清肺理痰方各組肺損傷的評分水平明顯降低 （P< 0.05）。見表1。

表1　各組大鼠血清IFN-γ水平、肺損傷指數比較（±s）

表1　各組大鼠血清IFN-γ水平、肺損傷指數比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對照組比較，△△P＜0.01。下同。

藥物劑量（g/kg）IFN-γ（pg/mL）-　0.16±0.07-　0.43±0.14△0.005　0.21±0.13**清肺理痰方低劑量組　8　6.00±1.73*組別　n　　肺損傷指數（分）正常對照組　8　1.00±0.00模型對照組　8　8.00±0.00△地塞米松組　8　4.00±1.73*3.95　0.36±0.10*清肺理痰方中劑量組　8　7.90　0.27±0.05**　5.33±0.58*清肺理痰方高劑量組　8　15.80　0.24±0.11**　4.33±0.58*

圖2各組大鼠肺組織病理光鏡下圖片（HE染色，100倍）

2.2各組血清炎癥因子IFN-γ水平比較見圖2。與正常對照組比較，模型對照組炎癥因子IFN-γ的水平明顯升高（P<0.01）。與模型對照組比較，地塞米松組和清肺理痰方各組IFN-γ的水平明顯降低（P<0.01），且高劑量組低于中劑量組，中劑量組低于低劑量組。

2.3各組大鼠肺組織NF-κB p65和TLR4蛋白表達比較見表2。與正常對照組比較，模型對照組NF-κB p65和TLR4蛋白表達均明顯升高（P<0.01）。與模型對照組比較，地塞米松組和清肺理痰方各組的NF-κB p65和TLR4蛋白表達均降低，且與劑量呈負相關（P<0.01）。

表2　各組大鼠肺組織NF-κB p65/TLR4蛋白IOD值的比較（±s）

表2　各組大鼠肺組織NF-κB p65/TLR4蛋白IOD值的比較（±s）

組別　n　TLR4蛋白IOD值正常對照組　8　484.10±30.94模型對照組　8　809.70±121.36△△地塞米松組　8　658.95±96.60**藥物劑量（g/kg） P65蛋白IOD值-　779.33±133.00-　1288.64±115.09△△0.005　892.67±191.11**清肺理痰方低劑量組　8　785.53±92.97*3.95　1109.09±105.86*清肺理痰方中劑量組　8　7.90　1094.03±72.86*　760.83±99.38*清肺理痰方高劑量組　8　15.80　1041.71±123.55*　749.82±49.06*

2.4各組大鼠肺組織NF-κB p65和TLR4 mRNA表達比較見表3。與正常對照組比較，模型對照組NF-κB p65和TLR4 mRNA相對表達量均明顯升高 （P< 0.01）。與模型對照組比較，地塞米松組和清肺理痰方各組的NF-κB p65和TLR4 mRNA相對表達量均降低，且與劑量呈負相關（P<0.05或P<0.01）。

表3　各組急性肺損傷大鼠肺組織P65/TLR4 mRNA的CT值相對表達量比較（×10-3，±s）

表3　各組急性肺損傷大鼠肺組織P65/TLR4 mRNA的CT值相對表達量比較（×10-3，±s）

與模型組比較，*P＜0.01；與正常對照組比較，△P＜0.01。

組別　n　TLR4正常對照組　8　0.83±0.18模型對照組　8　1.74±.096△地塞米松組　8　1.08±0.11*△藥物劑量（g/kg）　NF-κB p65-　0.76±0.10-　1.72±0.22△0.005　1.03±0.21*△清肺理痰方低劑量組　8　1.42±1.19*△3.95　1.31±0.16*△清肺理痰方中劑量組　8　7.90　1.25±0.11*△　1.24±0.29*△清肺理痰方高劑量組　8　15.80　1.18±0.61*△　1.16±0.14*△

3　討　論

研究表明，LPS信號通路的表達是通過跨膜傳導的“門戶蛋白”TLR4來實現的［10-11］，TLR4/NF-κB途徑參與了LPS誘導的 ALI［12-13］，發現在LPS介導的膿毒癥中NF-κB持續表達，和病情的嚴重程度正相關，這些都提示 TLR4/NF-κB通路可能是觸發炎癥反應和器官損傷的關鍵靶點。風溫肺熱病是風溫病與肺熱病的合稱，由風熱病毒引起的，而以冬春兩季多發的急性外感熱病；以發熱、咳嗽、咯痰、胸悶、舌紅苔白或黃、脈數為主癥，相當于西醫的急性肺炎等急性肺部感染疾病［14］。本病病因主要為外感火熱毒邪、風熱或風寒邪氣。其病變部位主要在肺，痰瘀互阻，導致肺臟功能失調［15］。本方由石膏、青天葵、瓜蔞皮、黃芩等10味中藥組成，具有解肌清熱，除煩止渴的功效，適用于肺熱實證。

實驗研究結果表明，模型組大鼠肺泡腔內充滿炎性滲出物和出血，肺損傷評分明顯增高，提示造模成功。與正常組相比，模型對照組NF-κB p65和TLR4蛋白和mRNA相對表達量均升高，結合前期實驗探究的機制可能是通過抑制NF-κB信號通路轉導活性，從而減少細胞因子分泌以減輕臟器組織損傷，進而發揮抗炎保護作用，提示ALI的病理變化與NF-κB p65和TLR4 mRNA表達的升高有關。用清肺理痰方灌胃處理大鼠，能使LPS誘導的ALI肺組織水腫、出血等損傷程度明顯減輕。與模型對照組比較，清肺理痰方各組血清IFN-γ含量下降、肺損傷的輕重程度評分降低，NF-κB p65和TLR4蛋白和mRNA表達水平下調，同時清肺理痰方各組隨著劑量增加肺損傷程度減低，表明清肺理痰方對內毒素致ALI大鼠有保護作用。其機制可能與其能降低內毒素致ALI大鼠肺組織NF-κB p65和TLR4蛋白和mRNA的表達有關。

鑒于以上結果，清肺理痰方對ALI的大鼠具有一定的保護作用，為中醫藥治療臨床ALI提供了研究方向，對中西醫結合治療肺部疾病提供了新思路。

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Ef fect of Qingfei Litan Decoction on NF-κB and TLR4 Expressions in LPS-induced Rats with Acute Lung Injury

WANG Kai，PAN Junhui，WANG Peng. The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangdong，Guangzhou 510120，China.

R285.5文獻標志碼：A

1004-745X（2016）06-1001-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.016

廣東省廣州市科技計劃項目（2012J4300068）

△（電子郵箱：pan-jh@163.com）

（2016-03-01）