苦參素對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其機制研究*

王雪芬王　磊陳樹杰（1.河北省邯鄲市第二醫院，河北 邯鄲 056001；.河北省邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲056001）

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苦參素對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其機制研究*

王雪芬1△王磊2陳樹杰2
（1.河北省邯鄲市第二醫院，河北 邯鄲 056001；2.河北省邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲056001）

目的 研究苦參素（OMT）對大鼠心肌缺血再灌注損傷大鼠的保護作用，并探討其可能的作用機制。方法 120只大鼠隨機分為假手術組，模型組，OMT（25、50、100 mg/kg）組和地爾硫（1 mg/kg）組；通過夾閉冠狀動脈30 min后松夾的方法制備心肌缺血再灌注損傷大鼠模型；再灌注后立即通過腹腔注射給藥治療（每天1次，療程7 d），假手術組和模型組給予等體積生理鹽水。通過TTC染色分析計算心肌梗死面積，測定心肌組織中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性和丙二醛（MDA）含量，測定血清中心肌酶（AST、CPK、LDH）含量，HE染色觀察心肌組織病理性形態學變化，TUNEL染色觀察心肌細胞凋亡狀況并計算凋亡指數（AI）；RT-PCR法測定心肌組織中Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達并計算Bcl-2/Bax表達比值，Western blot法測定心肌組織中Caspase-3、NF-κB蛋白表達。結果 經OMT（50、100 mg/kg）治療7 d能夠顯著降低心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織梗死面積，改善心肌組織中SOD、GSH-Px、CAT活性并降低MDA含量，降低血清中AST、CPK、LDH含量，改善心肌組織病變，抑制心肌細胞凋亡、降低AI，上調Bcl-2 mRNA表達、下調Bax mRNA表達，提高Bcl-2/Bax比值，降低心肌組織中Caspase-3、NF-κB蛋白表達；與模型組比較，上述差異均具有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。結論 OMT能夠降低心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織梗死面積、抑制心肌組織病變和心肌細胞凋亡、改善心功能，提示OMT對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護作用；作用機制可能與OMT能夠有效改善抗氧化酶活性、抑制氧化應激損傷，調節凋亡相關基因表達以及降低NF-kB蛋白表達有關。

缺血再灌注苦參素心肌保護機制

【Abstract】Objective：To investigate the protective effects of Oxymatrine（OMT）on the rats with myocardial ischemia-reperfusion injury and its mechanism.Methods：120 rats were randomly devided into six groups：sham operation group，the model group，OMT（25，50，100 mg/kg）treated groups and diltiazem（1 mg/kg）treated group；rat models with myocardial ischemia-reperfusion injury were made by clamping the artery for 30min；and the drugs were given after operation immediately，once a day for 7 days.The areas of myocardial infarction were analysised by TTC staining，the activity of SOD，GSH-Px，CAT and the content of MDA in myocardial tissue were determined，as well as the content of AST，CPK，LDH in serum；the histopathological changes of myocardial tissue was observed by HE staining，and the apoptosis of cardiomyocytes was observed by TUNEL and the apoptosis index（AI）was calculated；the expression of Bcl-2 mRNA and Bax mRNA were determined and the ratio of Bcl-2/ Bax were calculated；the expression of caspase-3 and NF-kB were examined with Western blot.Results：The myocardial infarction areas in OMT（50，100 mg/kg）treated groups were significantly decreased；the activity of SOD，GSH-Px，CAT in myocardial tissue were significantly increased and the activity of MDA was significantly decreased，as well as the level of AST，CPK，LDH in serum；the myocardial tissue histopathological changes and cardiomyocytes apoptosis were significantly improved；the AI in OMT（50，100 mg/kg）treated groups were significantly decreased；the expression of Bcl-2 mRNA was significantly up-regulated and the Bax mRNA was signifi-cantly down-regulated；the ratio of Bcl-2/Bax was significantly increased；the expression of caspase-3 and NF-kB protein were significantly decreased；compared with the model group，all of the difference above was significant（P <0.05 or P<0.01）.Conclusion：OMT can effectively lower the myocardial infarction areas of myocardial ischemia-reperfusion injury rats，inhibit the histopathological changes and cardiomyocytes apoptosis，and improve heart function，suggesting that OMT has protective effects on the rats with myocardial ischemia-reperfusion injury，which is perhaps related to its effects on enhancing the activity of antioxidant enzymes，inhibiting the oxidative stress，regulating the expression of apoptosis related genes and protein，and lowering the expression of NF-kB protein.

【Key words】Oxymatrine；Myocardial；Ischemia-reperfusion；Protection；Mechanism

冠心病及其所引發的急性心肌梗死已經發展成為嚴重危害人類生命健康的主要疾病，目前臨床上主要采取溶栓、介入、支架等方法及時恢復血流供應，極大降低了心肌梗死患者的死亡率，但“再灌注損傷”并發癥的存在嚴重影響著該類患者的愈后。因此，研究開發能夠有效改善再灌注損傷的藥物及治療方法，成為有效改善心肌梗死患者治療效果的關鍵?？鄥⑺兀∣MT）是從中藥苦參（Sophora flavescens Ait.）中提取的一種喹諾西啶類生物堿，具有抗炎、抗病毒、抗凋亡、抗肝纖維化等多種生物學活性［1-3］。有研究發現，OMT對腎臟、肝臟缺血再灌注損傷具有保護作用［4-5］，但仍未見文獻報道OMT是否對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護作用。本實驗通過夾閉冠狀動脈30 min后松夾恢復血流再灌注的方法制備心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，研究OMT對心肌缺血再灌注損傷大鼠的保護作用，并探討其可能的作用機制。現報告如下。

1　材料與方法

1.1藥物與試劑OMT（南京澤朗醫藥科技有限公司，批號20141025，純度≥98%）；注射用鹽酸地爾硫（天津田邊制藥有限公司，批號1408026）；TTC（美國Sigma公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、T-AOC和丙二醛（MDA）含量測定試劑盒，HE、TUNEL染色試劑盒 （南京建成生物工程研究所）；天門冬氨酸氫基轉移酶 （AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸磷酸激酶（CPK）測定試劑盒（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；RNA提取液Trizol試劑盒（北京Trans Gen公司）；bcl-2、bax的上下游引物 （上海博亞生物公司）；Caspase-3、NF-κB單抗 （碧云天生物技術有限公司）。

1.2實驗動物清潔級雄性SD大鼠（8周齡，體質量220～260 g），由河北省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（冀）2008-1-003，動物合格證號：201408026。

1.3主要儀器DH-150型動物人工呼吸機 （浙江大學醫學儀器有限公司）；wi93962生物機能實驗系統（北京北瑞達醫藥科技有限公司）；BS-300全自動生化分析儀 （深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；UV762型紫外-可見分光光度計 （上海楚定分析儀器有限公司）；RT-PCR儀 （武漢新未來儀器技術有限公司）；BI-2000醫用圖像分析系統；RM-2135型石蠟切片機 （德國Leica公司）；DYY-11型多用電泳儀、JYSCZ2電泳槽（北京六一儀器廠）。

1.4分組與造模120只實驗用大鼠隨機分為假手術組，模型組，OMT（25、50、100 mg/kg）組和地爾硫（1 mg/kg）組［6］。模型的制備：麻醉后通過肢體二導聯心電圖監測心功能，氣管切開、插管并連接動物呼吸機（頻率60次/min，潮氣量20 mL/kg，呼吸比1.5∶1）；穩定10 min后，開胸、剪開心包、暴露心臟，于左心耳下緣約2 mm處夾閉冠狀動脈，心電圖示ST段抬高或T波高聳表示心肌缺血；30 min后松開動脈夾恢復血流灌注，抬高的ST段降低或高聳的T波得以恢復表示心肌再灌注成功。假手術組行手術通路，除不夾閉冠狀動脈外，其余操作與試驗組完全一致。再灌注后，OMT各組和地爾硫組立即通過腹腔注射給藥治療，每天1次，療程7 d，假手術組和模型對照組給予等體積0.9%氯化鈉注射液。

1.5標本采集與檢測1）心肌組織梗死面積的測定：麻醉后開胸取心臟組織，用0.9%氯化鈉注射液沖洗干凈，-20℃凍存20 min后進行切片，于1%TTC溶液恒溫（37℃）避光孵育15 min，正常組織呈紅色、梗死區呈灰白色，然后通過BI-2000醫用圖像分析系統計算心肌組織梗死面積。2）心肌組織中抗氧化酶活性和MDA含量的測定：參照前法取心臟組織，剪碎后加入適量冷裂解液行研磨勻漿，3000 r/min離心10 min后取上清液，然后按照各試劑盒操作方法步驟，通過紫外-可見分光光度計平行測定各組大鼠心肌組織中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性和MDA含量。3）血清中心肌酶含量的測定：于前法取心臟組織前，開腹經腹主動脈取血并離心取血清，然后按照各試劑盒操作方法步驟，通過全自動生化分析儀測定各組大鼠血清中心肌酶（AST、CPK、LDH）含量。4）心肌組織病理性形態學變化的觀察：參照前法取心肌組織，經4%多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋，切片和展片處理后，行常規HE染色和封片處理，然后通過倒置光學顯微鏡觀察心肌組織病理性形態學變化并照相保存。5）心肌細胞凋亡的檢測：取制備的心肌組織石蠟切片，按照試劑盒操作步驟行TUNEL染色（細胞核黃褐色為陽性著色），然后通過光學顯微鏡觀察各組大鼠心肌細胞凋亡狀況并照相保存。凋亡指數（AI）的計算：每張染色切片隨機選取6個視野，分別計數細胞總數和陽性細胞數，各組分別取平均值，AI（%）=（陽性細胞數/細胞總數）× 100%。6）心肌組織中Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達的檢測及Bcl-2/Bax比值的計算：從基因庫中查閱大鼠Bcl-2、Bax、β-actin基因cDNA序列并通過Oligo軟件設計上、下游引物。Bcl-2：上游5′-GGGATGCCTTTGT GGAACTA-3′，下游5′-TGATTT GACCATTTGCCTGA-3′；Bax上游5′-ATCCAGGATCGAGCAGGGAGGATGG -3′，下游5′-AGATGGTCACTGTCTGCCATGTGGG-3′；β-actin上游5′-CCTGTATGCC TCTGGTCGTA-3′，下游5′-CCATCTCTTGCTCGAAGTCT-3′。取制備的心肌組織勻漿，加入適量Trizol試劑提取總RNA，測定總RNA濃度，取1 μg RNA反轉錄為cDNA，然后進行PCR反應，擴增完畢后，取PCR產物于瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像儀觀察并照相。以β-actin為內參，由灰度值進行半定量分析Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達，并計算bcl-2/Bax表達比值。7）心肌組織中Caspase-3、NF-κB蛋白表達的檢測：取上述所制備心肌組織勻漿液，經12000 r/min低溫（4℃）離心10 min后取沉淀，BCA法進行蛋白定量，然后通過Western blot法測定各組大鼠心肌組織中Caspase-3、NF-κB蛋白表達量，實驗結果應用Quantity One軟件進行分析。

1.6統計學處理運用SPSS15.0統計軟件分析。計量資料以（±s）表示，組間均數比較采用單因素方差分析；計數資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1各組大鼠心肌組織梗死面積比較見表1。模型組大鼠心肌組織梗死面積較假手術組顯著增高 （P< 0.01）；與模型組比較，OMT（50、100 mg/kg）組大鼠心肌組織梗死面積顯著減?。≒<0.05或P<0.01）。

表1　各組大鼠心肌組織梗死面積及心肌細胞AI比較（±s）

表1　各組大鼠心肌組織梗死面積及心肌細胞AI比較（±s）

與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

2.2各組心肌組織中 SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量比較見表2。模型組大鼠心肌組織中SOD、GSH-Px、CAT活性較假手術組顯著降低 （P< 0.01），MDA含量顯著升高 （P<0.01）；而與模型組比較，OMT（50、100 mg/kg）組大鼠SOD、GSH-Px、CAT活性顯著升高且MDA含量顯著降低 （P<0.05或P< 0.01）。

表2　各組大鼠心肌組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量比較（±s）

表2　各組大鼠心肌組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量比較（±s）

組別假手術組模型組OMT（25 mg/kg）組n 10 10 10 OMT（50 mg/kg）組　10 OMT（100 mg/kg）組　10地爾硫（1 mg/kg）組　10 SOD（U/mg）GSH-Px（U/mg）82.3±11.4　4.9±1.0 47.2±7.6**　2.6±0.8**54.1±8.5　2.9±1.1 62.9±10.3△　3.5±1.1△70.4±12.2△△　4.0±1.5△63.8±9.7△　3.1±1.3 CAT（U/mg）MDA（nmol/mg）4.6±1.3　2.4±0.5 2.5±0.9**　5.1±0.7**2.8±0.7　4.6±0.9 3.4±1.0△　3.5±0.6△△3.9±1.2△△　2.7±0.6△△3.5±0.9△　2.2±0.5△△

2.3各組大鼠血清中AST、CPK、LDH含量比較見表3。模型組大鼠血清中AST、CPK、LDH含量較假手術組顯著升高（P<0.01）；而與模型組比較，OMT（50、100 mg/kg）組AST、CPK、LDH含量均顯著降低 （P< 0.05或P<0.01）。

表3　各組大鼠血清中AST、CPK、LDH含量比較（U/L，±s）

表3　各組大鼠血清中AST、CPK、LDH含量比較（U/L，±s）

組別假手術組模型組OMT（25 mg/kg）組n 10 10 10 OMT（50 mg/kg）組　10 OMT（100 mg/kg）組　10地爾硫（1 mg/kg）組　10 AST　CPK 276.8±57.1　532.7±64.0 560.4±96.5**1005.4±142.9**519.2±103.7　876.1±137.2 431.6±85.2△　729.5±113.8△△385.7±71.9△△　671.4±98.6△△450.5±93.1△　753.8±120.4△LDH 618.2±73.5 1107.4±136.1**926.8±140.2 815.9±113.4△728.6±108.3△△942.7±144.1

圖1　各組大鼠心肌組織比較（HE染色，×400）

2.4各組大鼠心肌組織病變比較見圖1。觀察心肌組織病理切片發現，假手術組心肌組織結構和心肌細胞形態均未見異常；模型組心肌組織呈現心肌纖維紊亂、斷裂，間質水腫變性，心肌細胞呈空泡變性、胞質著色不均、胞核固縮等明顯的病理性形態學變化；與模型組比較，OMT組大鼠心肌組織病理性形態學變化明顯改善，以OMT（100 mg/kg）組效果最為顯著。

2.5各組大鼠心肌細胞凋亡情況比較見圖2、表1。假手術組僅可見極少量凋亡心肌細胞，模型組心肌細胞凋亡數量較假手術組明顯增多；而與模型組比較，OMT治療組大鼠心肌細胞凋亡數量明顯減少，其中以OMT（100 mg/kg）組最為顯著。比較AI發現：模型組心肌細胞AI較假手術組顯著升高（P<0.01）；而與模型組比較，OMT（50、100 mg/kg）組大鼠心肌細胞AI顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。

圖2　各組大鼠心肌細胞凋亡情況比較（TUNEL染色，×400）

2.6各組大鼠心肌組織中Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達和Bcl-2/Bax比值比較見表4。模型組心肌組織中Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表達均顯著升高 （P< 0.05或P<0.01），Bcl-2/Bax表達比值顯著降低 （P< 0.01）；與模型組比較，OMT（50、100 mg/kg）組 Bcl-2 mRNA表達顯著升高且Bax mRNA表達顯著降低，Bcl-2/Bax表達比值顯著升高，差異均具有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。

表4　各組大鼠心肌組織中Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達和Bcl-2/Bax比值比較（±s）

表4　各組大鼠心肌組織中Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達和Bcl-2/Bax比值比較（±s）

組別假手術組模型組OMT（25 mg/kg）組n 10 10 10 OMT（50 mg/kg）組　10 OMT（100 mg/kg）組　10地爾硫（1 mg/kg）組　10 Bcl-2（×10-3） Bax（×10-3）35.1±7.4　64.8±17.2 44.8±7.9*　120.5±31.7**51.6±9.3　104.6±35.1 62.4±11.5△　83.9±28.5△△70.1±12.2△△　76.0±24.1△△52.8±10.4　94.2±33.6△Bcl-2/Bax 0.54±0.23 0.36±0.17**0.43±0.21 0.74±0.28△△0.93±0.36△△0.56±0.18△

2.7各組大鼠心肌組織中Caspase-3、NF-κB蛋白表達比較見圖3、表5。模型組大鼠心肌組織Caspase-3、NF-κB蛋白表達量較假手術組顯著升高（P<0.01）；而與模型組比較，OMT（50、100 mg/kg）組Caspase-3、 NF-κB蛋白表達量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

圖3　OMT對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織Caspase-3、NF-κB蛋白表達的影響

表5各組大鼠心肌組織中Caspase-3、NF-κB蛋白表達比較（±s）

組別假手術組模型組OMT（25 mg/kg）組n 10 10 10 OMT（50 mg/kg）組　10 OMT（100 mg/kg）組　10地爾硫（1 mg/kg）組　10 Caspase-3/β-actin　NF-κB/β-actin 0.20±0.04　0.17±0.03 0.46±0.09**　0.43±0.09**0.41±0.10　0.39±0.08 0.36±0.07△　0.32±0.09△0.27±0.06△△　0.24±0.05△△0.32±0.08△　0.30±0.07△

3　討　論

缺血再灌注損傷是病理機制非常復雜，近年來Han ShX等［7］和Zhao YJ等［8］研究發現再灌注后，隨著氧的涌入和抗氧化酶活性降低氧自由基大量產生和過剩，而引發廣泛的氧化應激損傷以及其繼發的細胞凋亡可能是心肌缺血再灌注損傷重要的病理機制，這也為學者研發改善心肌缺血治療效果的新型藥物提供了新的思路。OMT是中藥苦參的主要活性成分之一，是喹諾西啶類生物堿，具有抗氧化和抗凋亡的生物學活性［5-9］。本實驗通過夾閉冠狀動脈30 min后松夾恢復血流再灌注的方法制備的心肌缺血再灌注損傷大鼠模型進行研究發現，OMT能夠顯著降低心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌梗死面積、抑制細胞凋亡、改善心肌組織病變，提示OMT對缺血再灌注損傷大鼠具有保護作用。

正常生理狀態下，體內氧自由基的生成與清除處于動態平衡，而缺血再灌注后氧的大量涌入與抗氧化酶活性的降低，將導致該平衡的破壞而引發氧化應激損傷。SOD是體內非常重要的抗氧化酶，它能夠催化還原氧自由基生成H2O2，并且能夠在GSH-Px或CAT的進一步催化作用下還原生成對人無害的H2O 和O2［10-11］，所以SOD、GSH-Px、CAT的活性能夠反映機體抗氧化能力；而脂質過氧化終產物MDA的含量也能間接反映機體氧化應激損傷程度。本實驗研究表明，經OMT（50～100 mg/kg）治療7 d能夠顯著改善抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性、降低MDA含量，降低血清中心肌酶（AST、CPK、LDH）含量，提示OMT具有降低心肌缺血再灌注大鼠氧化應激損傷、改善心功能的作用。

細胞凋亡是一種由多種基因參與調控的程序性死亡的過程，存在著非常復雜的調控機制。Bcl-2基因家族在細胞凋亡過程中起著非常重要的調控作用，其中Bcl-2抑制細胞凋亡、Bax促細胞凋亡，二者間相互作用共同調控細胞凋亡；并且細胞凋亡不僅與Bcl-2和Bax的表達密切相關，甚至更依賴于Bcl-2/Bax比值［12-13］。Caspases蛋白家族參與細胞凋亡啟動以及整個過程的調節，其中Caspase-3被認為是各種凋亡刺激因子激活的關鍵蛋白酶，Cspsase-3激活并介導心肌細胞凋亡被認為是心肌缺血再灌注損傷的重要機制之一［14］。細胞凋亡具有多種誘發因素，包括氧化應激損傷，而NF-κB蛋白則是連接氧化應激和細胞凋亡的“橋梁”；常態下，NF-κB以無活性形式存在于胞質中，而當受到外界因素刺激時NF-κB將進入胞核并調控靶基因的轉錄與表達，Zhang Q等［15］研究發現NF-κB激活與氧化應激誘導的心肌細胞凋亡密切相關。本實驗研究發現，OMT（50～100 mg/kg）治療7 d能夠明顯改善心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞凋亡狀況，顯著上調Bcl-2表達、下調促Bax表達、提高Bcl-2/Bax比值，降低凋亡相關蛋白NF-κB、Caspase-3表達，提示OMT能夠通過調節凋亡相關基因和蛋白的表達而起到抑制心肌細胞凋亡的作用。

綜上所述，OMT可能通過降低氧化應激損傷和抑制細胞凋亡對心肌缺血再灌注損傷大鼠起到保護作用；今后可通過培養心肌細胞并制作缺氧復氧損傷細胞模型、給予OMT進行干預，從而在體外細胞水平上進一步探討OMT對心肌缺血再灌注損傷的保護作用。

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The Protective Effects of Oxymatrine on the Rats with Myocardial Ischemia-reperfusion Injury and Its Mechanism

WANG Xuefen，WANG Lei，CHEN Shujie. Handan Second Hospital，Hebei，Handan 056001，China.

R285.5文獻標志碼：A

1004-745X（2016）06-0988-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.013

河北省衛生廳重點科技研究計劃（20130359）

△（電子郵箱：hdzxyywxl@163.com）

（2015-11-01）