燈盞細辛上調大鼠局灶性腦缺血再灌注后VEGF的實驗研究*

郭曉玲　張海波　陳　文　江雪蓮（湖北省十堰市太和醫院 湖北醫藥學院附屬醫院，湖北 十堰 442000）

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燈盞細辛上調大鼠局灶性腦缺血再灌注后VEGF的實驗研究*

郭曉玲張海波陳文江雪蓮△
（湖北省十堰市太和醫院 湖北醫藥學院附屬醫院，湖北 十堰 442000）

目的 研究燈盞細辛對大鼠局灶性腦缺血再灌注后血管內皮生長因子（VEGF）的影響，探討其對腦缺血再灌注損傷的保護機制。方法 SD大鼠30只，采用隨機數字表法隨機分為對照組、模型組及燈盞細辛組，采用線栓willis環的方法造模。治療用燈盞細辛尾靜脈給藥治療10 d，先測量治療前及第1、5、10日4個時點大鼠腦電圖病理性棘波（EEG）出現次數及局部腦血流量（rCBF），再采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測治療后缺血腦組織VEGF及VEGF受體Flk-1表達水平，并采用反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測VEGF-mRNA及Flk-1 mRNA表達，TTC染色觀察腦梗區細胞，比較腦梗死百分率。結果 與模型組比較，燈盞細辛組大鼠VEGF、Flk-1、VEGF mRNA及Flk-1F mRNA治療5 d后均上調，rCBF在第5、10日明顯增高，EEG明顯減少，腦梗死比例明顯縮小 （P<0.05）。結論 燈盞細辛可上調大鼠局灶性腦缺血再灌注后VEGF及VEGF受體Flk-1表達，這對減輕腦缺血再灌注后血管內皮炎癥反應程度、誘導缺血區血管內皮細胞增殖及血管新生、增加缺血區rCBF、縮小腦梗死區起到至關重要的作用，可明顯改善腦缺血再灌注損傷造成的血管內皮功能紊亂。

大鼠燈盞細辛局灶性腦缺血血管內皮細胞生長因子受體

【Abstract】Objective：To study Fleabane raising VEGF after focal cerebral ischemia and reperfusion in rats，and to explore the protective mechanism against cerebral ischemia reperfusion injury.Methods：30 SD rats were divided into the control group，the model group and fleabane group.Willis′circle was used to make models.Tail vein injection of Fleabane was given for 10 days.EEG and rCBF was detected before treatment and on 1st，5th and 10thday.ELISA was used to detect VEGF and Flk-1，RT-PCR for VEGF-mRNA and Flk-1mRNA.TTC was dyed to observe the cells of cerebral infarction；the percentage of cerebral infarction was compared.Results：Compared with the model group，VEGF，Flk-1，VEGF-mRNA and Flk-1FmRNA in fleabane group all rose 5 days after treatment；rCBF rose obviously on 5thand 10thday；EEG reduced obviously，as well as Cerebral infarction ratio（P<0.05）.Conclusion：Fleabane can raise VEGF and Flk-1after focal cerebral ischemia and reperfusion，which can reduce the extent of vascular endothelial inflammation after cerebral ischemia and reperfusion，induce ischemic vascular endothelial cell proliferation and angiogenesis，increase rCBF in the ischemic area，play a crucial role in reducing infarct area，and significantly improve endothelial dysfunction caused by cerebral ischemiareperfusion injury.

【Key words】Rats；Fleabane；Focal cerebral ischemia；Vascular endothelial growth factor；Receptor

急性腦梗死（ACI）發病急驟，常造成嚴重的傷殘后遺癥，病死率更高達30%以上，其病理改變主要是腦血管粥樣硬化斑塊脫落栓塞血管引起的急性血流障礙［1］，在使用溶栓藥或擴管藥治療后，由于血液再通，常造成腦缺血再灌注損傷而加重病情，出現急性腦功能缺損而致殘，嚴重者常導致患者死亡，是臨床常見的嚴重威協人類健康的腦血管意外。故其治療應重點考慮血液再通后造成腦缺血再灌注損傷，近年來臨床嘗試用中藥制劑燈盞細辛取得了可靠療效，但其對治療機制特別是對ACI溶栓治療后血管內皮再生的影響鮮有動物實驗。本實驗用燈盞細辛來干預大鼠局灶性腦缺血再灌注來觀察其對缺血腦組織血管內皮生長因子（VEGF）及受體Flk-1表達水平的影響，以揭示其保護機制。現報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組SD大鼠30只，體質量（200± 20）g，雄性，由湖北醫藥學院實驗動物中心提供［SCXK（鄂）2014-0008］，采用隨機數字表法隨機分為對照組、模型組、燈盞細辛組。用普通飼料喂養3組動物（每日50 g/kg），自由飲水，每籠1只，保證動物福利。

1.2藥品與器材燈盞細辛注射液（云南生物谷藥業股份有限公司，批號Z53021620）；水合氯醛（上海展云化工有限公司，批號302-17-0）；BL-420F生物機能實驗系統（成都泰盟電子有限公司）。AUY120島津電子天平（北京京海佳業科貿有限公司，型號AUY120）；大鼠VEGF及FLK-1 ELISA試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司，批號GRDS13-110，RDS13-115）；大鼠提取VEGF mRNA及FLK-1 mRNA RT-PCR試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司，批號GRDS13-106，GRDS13-107）；消毒自制尼龍栓線。

1.3造模及治療方法按文獻［2］手術步驟，所有大鼠實驗前禁食12 h，不禁水，按2.5 mL/kg的用量腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后仰臥位固定在大鼠手術臺上，頸胸部消毒后切開頸部皮膚，分離出入顱骨的翼腭動脈并用動脈夾夾閉之以防止栓線誤插入供應面部的小動脈，另一動脈夾夾閉頸總動脈，頸總動脈分頸外和頸內動脈2個分支，用眼科剪在頸內動脈剪一V形小口，將自制尼龍栓線插入18 mm或有阻力感為止（此時栓線已進入Willis環并阻斷供血），阻斷血流60 min后抽出絲線復灌，縫合并消毒手術創口。觀察大鼠行為，當出現下例情況之一者可作為造模成功標準：1）大鼠左前爪內收，或因前爪內收造成步態不穩；2）提起大鼠尾巴，懸空時左前爪不能伸展，左側前爪內收，行走時向左側轉圈。對照組10只大鼠手術步驟同上但不插入栓線阻斷血流作為對照。造模成功后燈盞細辛組按10 mg/kg的用量將燈盞細辛注射液從尾靜脈注射給藥，每日1次，對照組及模型組尾靜脈注射1 mL 0.9%氯化鈉注射液，3組都治療10 d。

1.4大鼠腦梗死百分率在治療10 d時，從3組大鼠中取5只，斷頭處死動物，迅速分離全部腦組織，濾紙吸干組織液，稱重后編號，-20℃低溫冰箱冰凍30 min，然后取出，用切片機以冠狀面切成厚2 mm的腦薄片，37℃的1%TTC溶液避光染色，30 min后用4%的多聚甲醛固定。高倍顯微鏡下觀察腦薄片，腦薄片梗死區經TTC染色后著色會加深，小心剝離出著色梗死部分稱重并計算腦梗死百分率，腦梗死百分率（%）=（梗死質量/總質量）×100%。

1.4大鼠基因檢測方法用BL-420F生物機能實驗系統記錄治療前后EEG，用記錄治療前后RCBF。按文獻方法［3］，在治療10 d從3組大鼠中取另5只，斷頭處死動物，分離腦組織編號后至-7O℃低溫冰箱，采用酶聯免疫吸附法 （ELISA）檢測治療前后缺血腦組織VEGF及其受體Flk-1表達水平。VEGF及VEGF受體Flk-1檢測方法參照文獻［4］，取低溫冰箱暫存的腦組織標本1/2，研磨后放入勻漿器中勻漿，3000 r/min離心30 min，嚴格按VEGF及其受體Flk-1的ELISA試劑盒說明操作，酶標儀讀數取 VEGF及VEGF受體Flk-1表達值。采用反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測VEGF-mRNA及Flk-1mRNA表達OD值。檢測時先對標本進行RNA提取，RT-PCR引物設計如下。FIK-1 mRNA上游引物：F 5'-TTAGGGGTGGGGTGGG G-3'。下游引物：R 5'-CTACTCCACTACCAAG-3。VEGF上游引物：F 5'GCGAAGCGAATTTCCAACAGA CG-3'。下游引物：R 5'GCGGTCGACATAGAGCTTGT AGGA-3'。VEGF-mRNA及Flk-1mRNA用上述引物擴增DNA片段。設計PCR反應條件：94℃預變性2 min，94℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，35個循。PCR擴增后產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，以DNAMarker標記確定條帶大小，經全自動凝膠成像分析系統進行掃描攝像以確定灰度比值（OD值）。

1.6統計學處理應用SPSS19.0統計軟件處理。數據以（±s）表示，符合正態分布，方差齊時采用t檢驗，方差不齊時采用校正t檢驗。治療前及第1、5、10日4個時點大鼠EEG及rCBF采用重復測量方差分析，梗死比例以百分率表示，采用χ2檢驗，檢驗水準為0.05。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1各組大鼠腦梗死百分率比較見表1。治療10 d病理圖片顯示，對照組著色均勻，神經纖維無壞死溶解，細胞排列整齊。模型組梗死區著色加深，神經細胞排列紊亂，有一部分已溶解，病理圖片顯示出現明顯壞死灶，梗死百分率為30.07%。燈盞細辛組有少量著色加深區，有極少部分的腦組織神經膠質細胞溶合，細胞排列整齊，腦梗百分率16.93%，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），提示燈盞細辛具有擴張梗死區微動脈、減少梗死百分率的作用。

表1　各組大鼠腦梗死百分率比較（±s）

表1　各組大鼠腦梗死百分率比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與對照組比較，△P＜0.05。下同。

組別　　正常（g）　　梗死百分率（%）對照組　0.121±0.014　0.00 n　　梗死（g）5　0.000±0.000模型組　0.085±0.016△　30.07*5　0.037±0.014△燈盞細辛組　5　0.021±0.012*0.104±0.008*　16.93*

2.2各組大鼠基因指標比較見表2。模型組VEGF、VEGF mRNA、FLK-1、FLK-1 mRNA明顯低于對照組（P＜0.05）。燈盞細辛組VEGF、VEGF mRNA、FLK-1、FLK-1 mRNA明顯增強，與模型組差異有統計學意義（P＜0.05），與對照組差異無統計學意義（P＞0.05），提示燈盞細辛能夠促進缺血區組織VEGF的表達，改善缺血部位腦組織血管新生。

表2　各組大鼠基因指標比較（±s）

表2　各組大鼠基因指標比較（±s）

組　別　n VEGF（ng/mL）VEGF mRNA（pg/mL）FLK-1（ng/mL）FLK-1 mRNA（pg/mL）對照組　5模型組　5 4.78±0.13　0.82±0.09　2.58±0.07　0.69±0.05 2.59±0.05△　0.60±0.10△　1.07±0.11△　0.27±0.09△燈盞細辛組　57.79±0.24*　1.74±0.13*　4.49±0.16*　2.82±0.12*

2.3各組大鼠腦缺血再灌注后EEG及rCBF的比較見表3。BL-420L生物信號采集記錄顯示，模型組大鼠腦缺血再灌注后第1、5、10日EEG明顯增多，rCBF降低，與對照組差異有統計學意義（P＜0.05），這說明腦缺血再灌注后損傷嚴重。燈盞細辛組第5、10日EEG明顯減少，rCBF增多，與模型組相比，經重復測量方差結果顯示球形假設檢驗P＜0.05，故不服從球形假設，因此F=152.87，P＜0.05；多變量檢驗結果中時間和分組交互作用，差異有統計學意義（P＜0.05），說明燈盞細辛能顯著降低大鼠腦缺血再灌注后抑制缺血異常，故腦電圖中異位棘波出現次數，改善微循環增加腦血流量的作用。

表3　各組大鼠腦缺血再灌注后EEG及rCBF比較（±s）

表3　各組大鼠腦缺血再灌注后EEG及rCBF比較（±s）

組 別　　時 間　EEG（Times/min）（rCBF=mL/100 g·min）對照組　　治療前　0.02±0.01　54.92±6.32 （n=5）　1 d　0.00±0.00　59.21±7.85 5 d　0.01±0.01　55.78±2.0 10 d　0.00±0.00　54.71±2.49模型組　　治療前　69.23±7.16△　23.35±4.90△（n=5）　1 d　70.12±8.32△　25.91±4.02△5 d　61.82±6.21△　21.32±1.57△10 d　66.74±6.72△　23.54±3.37△燈盞細辛組　治療前　67.81±7.21△　25.71±3.38△（n=5）　1 d　70.21±7.87△　27.02±3.07△5 d　31.37±5.30*△　33.27±4.97*△10 d　12.54±3.25*△　42.51±4.77*△

3　討　論

ACI的臨床癥狀和預后有賴于缺血區動脈側支循環的重建，因此，積極尋找具有促進缺血血管新生的藥物對缺血性疾病治療具有重大意義。燈盞細辛中藥名燈盞花，富含燈盞花乙素、總黃酮、總咖啡酸酯、總咖啡酸酯、野黃芩苷、高黃芩素、二咖啡酰、奎寧酸酯等［5］。藥用菊科植物短葶飛蓬之全草，性溫、味辛甘，具有消積止痛、活血化瘀之效。燈盞細辛注射液是燈盞細辛全草現代工藝提取的酚酸類滅菌注射液，主要有效成分燈盞花乙素、總黃酮、總咖啡酸酯及野黃芩苷，具有激活纖溶酶的活性及擴張血管的作用，還具有抗凝、溶栓、清除自由基、抑制炎癥因子釋放及機體脂質過度氧化的藥理效應［6］，臨床主要用于治療缺血性中風、冠心病心絞痛等。

血管內皮功能的完整性取決于機體氧自由基的生成與清除，一般情況下，氧自由基的生成與清除保持動態平衡，血管內皮功能保持正常。當血管狹窄或栓塞，特別是ACI時，腦組織局部血管急性血流障礙造成急性缺血缺氧，ATP供應不足，細胞Na-K+-ATP大量釋放，Ca2+內流并有可能造成鈣超載，細胞內鈣超載會破壞線粒體結構及功能，進一步導致能量代謝紊亂，機體氧自由基、白細胞介素-2及前列腺素也大量產生，造成血管內皮細胞受損嚴重［7］。VEGF具有增加微、小靜脈血管的通透性、促使血管內皮細胞分裂增殖及誘導血管生成再生等作用［8］。VEGF又分B、C、D等亞型，對缺血后血管內皮再生都有相似的作用［9］。VEGF的受體Flk-1在損傷組織上會大量表達，其增多說明VEGF的活性增強。

在本實驗中，模型組VEGF及FLK-1、VEGF mRNA及FLK-1 mRNA表達均有不同程度的下降，大鼠腦缺血再灌注后EEG增多，rCBF急劇下降的，說明缺血再灌注造成了嚴重損傷，且是不可逆的。模型組梗死百分率高達30.07%，燈盞細辛組TTC染色顯示有少量著色加深區，有極少部分的腦組織神經膠質細胞溶合，細胞排列整齊，腦梗百分率16.93%，提示燈盞細辛具有擴張梗死區微動脈、減少梗死百分率的作用。燈盞細辛組VEGF及FLK-1、VEGF mRNA及FLK-1 mRNA在治療后表達均明顯上調，說明燈盞細辛可增加FLK-1的數量，使VEGF表達上調，這對誘導缺血腦組織血管新生，促進受損血管內皮修復具有肯定作用。其機制可能與燈盞細辛活血化瘀的藥理作用有關，一方面可能抑制ATP酶過多釋放，降低細胞內鈣超載的可能，也可能通過Na-K+-ATP酶調節Na+-H+交換來抑制Na+-Ca2+交換，經阻止過多的Ca2+內流來改善缺血腦組織能量代謝［10］。由于VEGF對血管內皮細胞具有特異性的促有絲分裂作用［11］，可促進缺血腦組織內血管分化和生成，這對側支循環血管重塑和建立具有重要意義［12］。實驗表明，燈盞細辛具有增加VEGF的受體 FLK-1表達作用，FLK-1增多進一步。促進VEGF的合成與分秘增加，促進血管內皮損傷后血管內皮再生，進而促使血管重塑而達到維持血管的完整性的目的；另一方面，燈盞細辛擴張腦血管，抑制炎性介質的形成或釋放，防止缺血腦神經元損傷，改善神經細胞功能，還可使機體內排膚類被激活，清除局部組織的五羥色胺等致敏原，降低神經興奮性，消除異常放電（實驗中EEG減少），增加rCBF，改善微循環，增加腦組織供氧有關。在ACI時，腦組織供血供氧有賴于缺血側支循環的形成，這可以減輕腦組織的缺血缺氧現象，避免腦組織缺血壞死，改善血液再通后造成腦缺血再灌注損傷后的臨床癥狀。總之，注射燈盞細辛可起擴張局部微血管，增加組織灌注，改善局部血液循環，消除局部炎癥，達到活血化瘀、止痛消積之功效［13］。但缺血再灌注損傷有多因素參與的復雜代謝過程，燈盞細辛如何在各個環節發揮調節及干預、阻斷缺血/再灌注損傷的發生，還有待深入研究。

［1］ 左霞，陳紅英，陳德森，等.參麥注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響［J］.國際中醫中藥雜志，2015，12（2）：148-149.

［2］徐艷煒，孫莉，梁浩，等.腦缺血中12/15-脂氧合酶對過氧化物酶體增殖物激活受體γ調節作用的初步探討［J］.中華神經科雜志，2014，47（2）：123-127.

［3］ 侯凌波，喬利軍，郭建文，等.燈盞細辛注射液對血瘀型急性腦梗死患者血清VEGF、MMP-9、EPCs水平的影響［J］.中成藥，2015，37（11）：2373-2376.

［4］ Jing JIN，Chao PENG，Su-zhen WU，et al.Blocking VEGF/ Caveolin-1 signaling contributes to renal protection of fasudil in streptozotocin-induced diabetic rats［J］.Acta Pharmacologica Sinica，2015，12（7）：831-840.

［5］王棟，翟誠順，孫曉敏，等.燈盞細辛注射液治療不穩定型心絞痛及對超敏C反應蛋白的影響［J］.中國中醫急癥，2012，21（8）：1354-1355.

［6］尹智功，肖敬，蔣耀平，等.燈盞細辛注射液臨床應用進展［J］.中國中醫急癥，2009，18（12）：2046-2047.

［7］王曉娟.丹參多酚酸鹽對大鼠骨髓間充質干細胞增殖及血管內皮生長因子表達的影響 ［J］.環球中醫藥雜志，2013，（7）：492.

［8］王鑫焱，盧國玲，李子王，等.復方丹參飲對急性心肌缺血大鼠心肌血管內皮生長因子表達的影響［J］.中國中醫藥科技，2014，2（2）：149-151.

［9］胡安義，劉莉.丹紅注射液對不穩定型心絞痛患者 血管內皮功能及炎癥因子的影響［J］.醫藥導報，2011，30（3）：320-321.

［10］賈鳳玖，姚衛華，趙青山，等.燈盞細辛和燈盞細辛聯合應用對急性局灶性腦缺血患者肌鈣蛋白 T的影響［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2013，11（11）：1385-1386.

［11］郭獻陽，陳如杰，莊榮，等.燈盞細辛注射液對ARDS炎性因子及凝血機制的影響［J］.中國中醫急癥，2015，24（5）：854-855.

［12］貝寧，貝箏，王英，等.燈盞細辛注射液聯合黃芪注射液治療缺血性腦卒中急性期的臨床研究［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2015，11（9）：1123-1124.

［13］夏旺旭，徐露.燈盞花素對腦梗死大鼠腦保護作用的影像學觀察及機制研究［J］.中國中醫急癥，2015，24（5）：950-952.

［14］劉新迎，巫祖強，李蓉，等.燈盞細辛合尼莫地平對谷氨酸所致神經元凋亡的影響［J］.中國中醫急癥，2015，24（8）：l367-1369.

［15］苗建國，陳淑敏.燈盞細辛注射液聯合胞磷膽堿鈉膠囊治療腦梗死的臨床研究［J］.現代藥物與臨床，2016，12（1）：41-44.

Research of Fleabane Raising VEGF after Focal Cerebral Ischemia and Reperfusion in Rats

GUO Xiaoling，ZHANG Haibo，CHEN Wen，et al. Orthopedics Department，Taihe Hospital of Shiyan，Hubei Medical College Affiliated Hospital，Hubei，Shiyan 442000，China.

R285.5文獻標志碼：A

1004-745X（2016）06-0985-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.012

湖北省教育廳科研項目（15D081）

△（電子郵箱：guoxiaolingxl@126.com）

（2016-01-30）