益氣活血方對大鼠慢性脊髓壓迫后受損脊髓組織形態(tài)學(xué)及其PGE2、PLA2含量的影響

楊　宇夏建龍△　陳　剛楊　挺蔡　平（.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 003；.江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 0046）

?

益氣活血方對大鼠慢性脊髓壓迫后受損脊髓組織形態(tài)學(xué)及其PGE2、PLA2含量的影響

楊宇1夏建龍1△陳剛2楊挺1蔡平2
（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2.江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210046）

目的 觀察不同濃度的益氣活血方對大鼠慢性脊髓壓迫后受損脊髓組織的形態(tài)學(xué)及其前列腺素E2（PGE2）、磷脂酶A2（PLA2）含量的影響。方法 60只SD大鼠，隨機(jī)選取10只作為假手術(shù)組，僅暴露椎板，未造成脊髓壓迫，以0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行灌胃；其余的SD大鼠采用自體第7頸椎棘突椎間移植法制造大鼠脊髓壓迫模型，術(shù)后1 d根據(jù)脊髓功能的評分將其分為，A組造模后，以不同濃度的益氣活血方進(jìn)行灌胃；B組造模后，以頸復(fù)康進(jìn)行灌胃；C組造模后，以0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行灌胃。灌胃結(jié)束，處死動(dòng)物并取其受損脊髓組織做以下處理：1）經(jīng)HE染色后觀察受損脊髓組織的形態(tài)學(xué)改變；2）采用ELISA方法測其PGE2、PLA2的含量。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)手段對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，基于上述結(jié)果綜合評估益氣活血方和頸復(fù)康對炎性介質(zhì)的抑制功效。結(jié)果 受損脊髓組織形態(tài)學(xué)的觀察結(jié)果顯示；中藥高、中、低濃度組以及頸復(fù)康組的受損脊髓組織內(nèi)均可見膠質(zhì)瘢痕和空洞形成，且空洞總面積均明顯小于NS組。通過檢測大鼠受損脊髓組織中的炎癥因子發(fā)現(xiàn)，中藥中濃度、中藥高濃度及頸復(fù)康均能顯著降低受損脊髓組織內(nèi)PGE2的含量（P<0.05），各濃度的益氣活血方及頸復(fù)康均能顯著減低受損脊髓組織內(nèi)PLA2的含量（P<0.05）。結(jié)論 在大鼠慢性脊髓壓迫模型中，益氣活血方能有效抑制受損脊髓組織的炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)其脊髓功能的恢復(fù)。

益氣活血方大鼠脊髓型頸椎病前列腺素磷脂酶A2HE染色

【Abstract】Objective：To evaluate the potential effects of different concentrations of PNQAB（the prescription for nourishing qi and activating blood）on morphological changes and contents of PGE2，PLA2in the damaged rats′spinal cord tissue.Methods：Ten SD-Rats were randomly chosen as the sham-operated group from the sixty subjects，fed with the normal saline within explosion of the vertebral lamina and free from oppression of the spinal cord；the remaining were applied to establish rat′s spinal oppression model by grafting the self-7th cervical vertebrae spinous process at the part of C4～5 or C5～6 intervertebral space，then divided into three groups based on the assessment results of the spinal cord function at the 1st day postoperatively，fed with the PNQAB under different concentrations（Group A），Jinfukang（Group B）and Normal saline（Group C），respectively.All the animals were sacrificed by the end of the gastric perfusion and the damaged tissue of spinal cord was removed for the examination of morphological changes（after HE staining）and the determination of contents of PGE2and PLA2（tested with ELISA method）of the specific tissue in rats′spinal cord.Results：The results of HE staining showed that glial scars and cavitation were sporadically formatted in Group A and Group B，but existed widely in Group C，and the total areas of cavitation in Group A and Group B were obviously less than Group C.Furthermore，groups fed with the PNQAB under high/medium concentration and Jinfukang could notably decreased the content of PGE2（P< 0.05），while all the groups fed with the PNQAB and Jinfukang had a positive effects on the inhibition of PLA2production in the tissues of the rats′damaged spinal cord significantly（P<0.05），compared with those fed with normal saline.Conclusions：The PNQAB effectively inhibits inflammatory response in tissues during rat′s recovery of chronic spinal oppression model，and promotes the recovery of spinal cord function.It is an effective treat-ment method，worthy of further promotion.

【Key words】PNQAB；Rat；Cervical spondylotic myelopathy；PGE2；PLA2；HE staining

脊髓型頸椎病 （CSM）是由于頸椎間盤退變及突出、椎體后緣及鉤椎關(guān)節(jié)骨質(zhì)增生、后縱韌帶骨化、黃韌帶肥厚或鈣化，導(dǎo)致脊髓受壓、缺血，繼而出現(xiàn)脊髓功能障礙的疾病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為頸項(xiàng)部疼痛、上肢酸脹、疼痛、麻木、無力感，嚴(yán)重者可出現(xiàn)上肢肌力下降，握拳困難，手指精細(xì)動(dòng)作減弱，行走不穩(wěn)、易摔跤以及肢體的觸痛覺減退或過敏，胸腹部的束帶感。本病好發(fā)于中老年人；發(fā)病率一般為人群的10%～15%；男性多發(fā)，本病常因天氣變化；寒冷刺激；勞累等原因誘發(fā)。益氣活血方在圣愈湯的基礎(chǔ)上加減而成；原方出自《脈因證治·金瘡》卷四；為著名醫(yī)家朱震亨所創(chuàng)。導(dǎo)師在臨床中；以該方為基本方，隨癥加減，靈活運(yùn)用，用于治療CS以及改善CS術(shù)后的脊髓功能狀態(tài)；對治療該病具有很好的療效；且服用安全、方便。筆者采用大鼠自體第7頸椎棘突椎間移植法制造大鼠脊髓壓迫模型，來觀察益氣活血方對大鼠慢性脊髓壓迫后受損脊髓組織的形態(tài)學(xué)及其前列腺素E2（PGE2）、磷脂酶A2（PLA2）含量的影響，以期為益氣活血方的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，雌雄各半，60只，體質(zhì)量（200±2）g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SPF級，許可證號：SCXK（京）2012-0001。

1.2試劑與儀器黃芪、陳皮、甘草、桂枝、羌活、丹參、茯苓、當(dāng)歸、蜈蚣、延胡索、地龍、獨(dú)活、澤蘭、葛根、0.9%氯化鈉注射液、酒精、碘伏、青霉素、均購置于江蘇省中醫(yī)院，頸復(fù)康（益豐大藥房，批號490283），純水、多聚甲醛由南京中醫(yī)藥大學(xué)唐仲英實(shí)驗(yàn)室提供，10%水合氯醛 （國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20140115），PGE2、PLA2試劑盒購置于南京建成生物研究所并由其研究所代測，HE染色由南京市婦幼保健院代測。刀柄、眼科剪、線剪、有齒鑷、無齒鑷、持針器、彎鉗、直鉗、萬分之一天平、剃毛機(jī)等均由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥理研究室提供，1 mL注射器、針、線、23號刀片、醫(yī)用紗布、棉球均購置于江蘇省中醫(yī)院。

1.3樣品制備分別取中藥材于江蘇省中醫(yī)院代煎，將煎好的中藥按成人臨床用藥量的20倍換算為高濃度、10倍換算為中濃度、5倍換算為低濃度，在南京中醫(yī)藥大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室濃縮，中藥高濃度濃縮至5.4 g/mL（生藥）、中藥中濃度將高濃度用純水等倍稀釋至2.7 g/mL（生藥）、中藥低濃度將中濃度用純水等倍稀釋至1.35 g/mL（生藥）；用研缽將頸復(fù)康磨細(xì)之后，用純水配制成0.17 g/mL；用萬分之一天平稱取10 g水合氯醛，用100 mL純水配制成10%水合氯醛備用。

1.4大鼠脊髓壓迫模型參考文獻(xiàn)［1］。隨機(jī)選取10只，為假手術(shù)組（只暴露頸椎椎板，不咬除椎板，不造成大鼠脊髓壓迫模型），其余50只均在10%水合氯醛（0.4 mL/kg）麻醉下，用剃毛機(jī)剃除大鼠頸后部的毛，常規(guī)碘伏消毒，鋪巾，取大鼠頸椎后正中切口長3～4 cm，切開皮膚、皮下，暴露頸肩部肌群，找到第七頸椎棘突（所有頸椎棘突均可用手觸及，最高突起處即是），自下往上正中切開肌肉群向兩側(cè)牽開，沿棘突兩側(cè)以23號刀片剝離棘突上附著肌肉，即可暴露整個(gè)頸椎骨面；自第7頸椎棘突基底部離斷第7頸椎棘突并取出，刮除骨面附著組織備用；自第7頸椎棘突往上找到第5或6頸椎椎板，咬除部分椎板，并取相應(yīng)直徑的第7頸椎棘突骨塊植入椎間隙，以不出現(xiàn)松動(dòng)為度，并盡量向椎管內(nèi)嵌壓，以出現(xiàn)上肢肌肉反射性抽搐為度，縫合肌肉、皮膚，肌肉注射青霉素8萬U/只，術(shù)畢。青霉素連續(xù)肌肉注射3 d，術(shù)前及術(shù)后均不必禁食。為了避免老鼠相互擠壓造成的傷害甚至死亡，術(shù)后采取單籠喂養(yǎng)并任其自由活動(dòng)，造模過程中由于麻醉劑量控制不精準(zhǔn)導(dǎo)致術(shù)中大鼠死亡7只，3只可能是因?yàn)槭中g(shù)創(chuàng)傷太大從而導(dǎo)致全身衰竭而亡。

1.5分組及給藥為了使大鼠脊髓的急性壓迫轉(zhuǎn)為慢性壓迫，術(shù)后適應(yīng)性觀察2周，待大鼠傷口基本愈合后采取合籠喂養(yǎng)，為保證脊髓損傷輕與重的大鼠在每組中的數(shù)量相當(dāng)，術(shù)后1 d根據(jù)改進(jìn)Rivaling的斜板實(shí)驗(yàn)的平均度數(shù)、Tarlov評分、Basso Beattie Bresnahan （BBB）評分將其分為益氣活血方高濃度組［（54 g/（kg·d）］、益氣活血方中濃度組［27 g/（kg·d）］、益氣活血方低濃度組［13.5 g/（kg·d）］組、頸復(fù)康組（1.7 g/kg）、NS組，益氣活血方高、中、低濃度組以及頸復(fù)康組采用1 mL/ 100 g灌胃給藥，NS組及假手術(shù)組灌服等量 （1 mL/ 100 g）0.9%氯化鈉注射液，每日給藥1次，連續(xù)4周。

1.6取材取材后以壓迫點(diǎn)為中心分成兩部分，一部分放于4%多聚甲醛中保存用于HE染色，另一部分放進(jìn)液氮中凍存，后轉(zhuǎn)入-70℃冰箱中保存，用時(shí)取出用于檢測PLA2、PGE2的含量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以（±s）表示，進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）和兩兩比較的LSD和Tamhane'T2（M）檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1各組大鼠脊髓組織中PGE2、PLA2的含量見表1。中藥中濃度、中藥高濃度及頸復(fù)康均能顯著降低受損脊髓組織內(nèi)PGE2的含量，與NS組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），中藥低濃度亦能顯著降低其PGE2的含量，與NS組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；各濃度的益氣活血方及頸復(fù)康均能顯著減低受損脊髓組織內(nèi)PLA2的含量，與NS組比較有顯著差異（P<0.05），抑制受損脊髓組織內(nèi)PGE2、PLA2的含量效果強(qiáng)弱順序?yàn)椋褐兴幐邼舛?頸復(fù)康>中藥中濃度>中藥低濃度，表明益氣活血方具有通過抑制受損脊髓組織內(nèi)炎性介質(zhì)的產(chǎn)生來抑制炎癥反應(yīng)，消除脊髓神經(jīng)細(xì)胞的水腫的作用，從而改善脊髓周圍組織的痛覺過敏狀態(tài)，緩解疼痛，達(dá)到治療脊髓型頸椎病的效果。

表1　各組大鼠脊髓組織中PGE2、PLA2含量比較（±s）

表1　各組大鼠脊髓組織中PGE2、PLA2含量比較（±s）

與NS組比較，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

組 別　n　PGE2含量（ng/L）PLA2含量（ng/mL）中藥低濃度組　8　196.258±8.388　33.757±1.234*中藥中濃度組　9　194.084±16.028*　33.209±0.872**中藥高濃度組　9　186.553±8.514**　31.676±0.678***頸復(fù)康組　9　191.182±17.451*　32.773±1.207***NS組　8　207.298±9.106　35.247±1.465假手術(shù)組　7　170.851±13.627***　30.528±1.716***

2.2各組大鼠脊髓組織常規(guī)病理染色結(jié)果見圖1和圖2。假手術(shù)組中神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞形態(tài)完好，細(xì)胞核染色為藍(lán)黑色，細(xì)胞核完整，脊髓組織結(jié)構(gòu)正常，無空泡樣改變；NS組可見大量的神經(jīng)細(xì)胞核固縮，細(xì)胞腫脹、壞死，脊髓組織內(nèi)可見大量的瘢痕組織及大空泡樣改變；中藥高濃度組可見少量的脊髓組織空洞及瘢痕組織，散在細(xì)胞核固縮，空洞周圍存在大量的神經(jīng)元樣細(xì)胞，細(xì)胞核分布逐漸集中分布；中藥中濃度組可見脊髓組織空洞較小，少量瘢痕組織及固縮的細(xì)胞核，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)趨于正常，胞漿也逐漸增多；中藥低濃度組可見脊髓組織呈大量的小空泡樣改變及固縮的細(xì)胞核呈游離狀態(tài)分布，存在形態(tài)正常的神經(jīng)元樣細(xì)胞；頸復(fù)康組可見較多的空泡樣改變及少量瘢痕組織，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞壞死，周圍存在正常形態(tài)的神經(jīng)元樣細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了，益氣活血方具有促進(jìn)受損脊髓組織內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)作用。

圖1　各組大鼠脊髓組織常規(guī)病理染色結(jié)果（HE染色，×400）

3　討　論

脊髓型頸椎病在臨床上主要以實(shí)證、虛證及虛實(shí)夾雜證常見，實(shí)證以痹證居多；常表現(xiàn)為肢體的疼痛麻木、酸脹，無力感，其病在脾；由瘀血、痰濕等所致。虛證以痿證為多；表現(xiàn)為肌肉萎軟無力、行走不穩(wěn)，其病在脾、腎；屬氣虛、腎虧所致。本病為本虛標(biāo)實(shí)，氣血不足，瘀血內(nèi)阻，髓失所養(yǎng)之證。勞則耗氣，久勞其氣必虛；“氣為血之帥”“氣行則血行”，氣虛導(dǎo)致血瘀，血瘀導(dǎo)致不通則痛；氣能生血，氣虛則血亦虛，肌膚、筋骨、脊髓失于濡養(yǎng)則可出現(xiàn)肢體麻木、肌肉萎軟無力、行走不穩(wěn)等癥狀；脾失健運(yùn)；水濕不化；濕著于內(nèi)則衛(wèi)氣不榮；肌肉頑痹；此外；氣血失和；筋脈失養(yǎng)；腠理空虛；風(fēng)寒濕邪乘虛而入；合而為痹。根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論“氣行則血行，治血先治氣”的觀點(diǎn)，筆者以圣愈湯的為主方加減組成“益氣活血方”，其組成為黃芪、陳皮、甘草、桂枝、羌活、丹參、茯苓、當(dāng)歸、蜈蚣、延胡索、地龍、獨(dú)活、澤蘭、葛根等14味中藥，方中重用黃芪、當(dāng)歸、丹參為君藥，取其補(bǔ)益氣血、活血化瘀之功，延胡索、地龍、蜈蚣、桂枝活血化瘀通絡(luò)，羌活、獨(dú)活祛風(fēng)勝濕止痛，陳皮、茯苓、澤蘭燥濕利水，葛根生津舒筋，甘草調(diào)和諸藥，諸藥共奏益氣活血、利水消腫、通絡(luò)止痛之功。

脊髓型頸椎病屬中醫(yī)學(xué)中的“痹”“痿”等證范疇。《濟(jì)生方·痹》亦云“皆因體虛；腠理空疏；受風(fēng)寒濕氣而成痹也”。研究表明脊髓組織受壓迫、損傷能引起炎癥反應(yīng)；PLA2可促進(jìn)前列腺素、白三烯、血栓素、血小板活化因子等重要炎性介質(zhì)的分泌［2］，PGE2作為一種炎性標(biāo)志物［3］，除了引起血管擴(kuò)張外，還能增強(qiáng)局部血管通透性，刺激脊髓局部產(chǎn)生水腫。脊髓、神經(jīng)根周圍的炎癥是引起頸項(xiàng)部疼痛的主要原因，且PGE2在炎癥過程中扮演著重要角色［4］。藥理實(shí)驗(yàn)顯示黃芪提取物具有明顯的抗炎作用［5］；其抗炎機(jī)制與黃芪甲苷能抑制NF-κB途徑有關(guān)［6］。《景岳全書·本草正》云“當(dāng)歸，功專補(bǔ)血，又能行血，補(bǔ)中有動(dòng)，行中有補(bǔ)，誠血中之氣藥，亦血中之圣藥也”。當(dāng)歸在保護(hù)損傷神經(jīng)及促進(jìn)神經(jīng)再生方面具有重要作用［7］，同時(shí)，當(dāng)歸通過抑制血小板凝聚等作用來達(dá)到“活血”的效果，并通過抑制PGE2產(chǎn)量、COX-2活性以及COX-2 mRNA和蛋白的表達(dá)來達(dá)到抗炎的作用［8］。丹參可明顯降低中性粒細(xì)胞的趨化性，抑制溶酶的釋放，降低血中的PGE2和PGF2α的水平，這是丹參抗炎的主要機(jī)制［9］。黃芪、丹參、當(dāng)歸等能直接擴(kuò)張周圍血管，明顯改善微循環(huán)；對滲出的炎性介質(zhì)有明顯的抑制作用［10］；能減輕神經(jīng)水腫、炎癥、出血、變性和脫髓鞘，來促進(jìn)神經(jīng)的再生［11］；方中諸藥合用，有明顯的抗炎以及改善脊髓型頸椎病術(shù)后的脊髓功能狀態(tài)的作用。脊髓損傷后組織內(nèi)的血流量改變是導(dǎo)致脊髓神經(jīng)功能喪失的重要因素［12］。丹參促進(jìn)受損脊髓的修復(fù)作用與類抗血小板聚集以及對抗縮血物質(zhì)的作用有關(guān)［13］。

該研究可以證明，益氣活血方具有抑制炎癥反應(yīng)，改善受損脊髓周圍組織的痛覺過敏狀態(tài)，抑制受損脊髓組織瘢痕化以及空泡的形成，促進(jìn)受損神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)，緩解神經(jīng)細(xì)胞的變性、壞死的作用，相關(guān)臨床研究表明圣愈湯［12］、益氣活血方［13］對改善脊髓型頸椎病術(shù)后的脊髓功能狀態(tài)有顯著的療效，其機(jī)制還有待于進(jìn)一步的深入研究。

［1］徐遠(yuǎn)坤.大鼠脊髓型頸椎病動(dòng)物模型初探［J］.中國中醫(yī)骨傷科雜志，2007，15（3）：19-21.

［2］唐占英.益氣化瘀補(bǔ)腎方對壓迫和減壓后大鼠背根節(jié)神經(jīng)元PLA2、PGE2表達(dá)影響［J］.四川中醫(yī)，2012，30（9）：36-38.

［3］Benneker LM，Heini PF，Alini M，et al.2004 Young Investigator Award Winner：vertebral endplate marrow contact channel occlusions and intervertebral disc degeneration［J］.Spine，2005，30（2）：167-173.

［4］施杞，郝永強(qiáng)，彭寶淦，等.動(dòng)靜力平衡失調(diào)與頸椎病——頸椎病動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究［J］.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，13（1）：52-56.

［5］朱華野，樸龍.黃芪提取物抗炎、鎮(zhèn)痛、耐缺氧及抗疲勞作用的研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007，18（5）：1156-1157.

［6］朱燕輝，嚴(yán)奉祥.黃芪甲苷及其生物學(xué)活性［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，8（4）：781-783.

［7］陳旭東，趙四敏，華新宇，等.當(dāng)歸對宮內(nèi)缺氧后新生大鼠大腦CA3區(qū)神經(jīng)元及NMDAR1 mRNA表達(dá)的影響［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21（9）：2182-2183.

［8］李曦，張麗宏，王曉曉，等.當(dāng)歸化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.中藥材，2013，36（6）：1023-1028.

［9］豐成相.丹參的化學(xué)成分及藥理作用概況［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2012，21（2）：25-26.

［10］孫映君.中藥藥理學(xué)［J］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：384.

［11］徐孝麟.參麥注射液的臨床應(yīng)用進(jìn)展［J］.中國實(shí)用醫(yī)藥，2006，1（4）：43.

［12］陳博來，鄧晉豐.活血化瘀中藥對大鼠脊髓損傷后血管內(nèi)皮素及功能恢復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.新中醫(yī)，2005，37（10）：94-99.

［13］韋理，張俐.丹參注射液對急性脊髓損傷大鼠脊髓灰質(zhì)GDNF mRNA的提高作用及其機(jī)制［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，33（7）：933-937.

［14］夏建龍，楊挺，李松濤.圣愈湯加減對脊髓型頸椎病術(shù)后脊髓功能狀態(tài)的干預(yù)［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（15）：201-204.

［15］王亮.益氣活血方治療脊髓型頸椎病術(shù)后 78例臨床觀察［J］.吉林中醫(yī)藥，2012，32（11）：36-37.

Effects of QNPAB on Morphological Changes and the Contents of PGE2 and PLA2 in Damaged Rats′Spinal cord Tissue of the Chronic Spinal Oppression Model

YANG Yu，XIA Jianlong，CHEN Gang，et al.Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu，Nanjing 210046，China.

R969文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

1004-745X（2016）06-0971-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.008

江蘇省中醫(yī)藥管理局科研課題（LZ13012）

△（電子郵箱：drjlxia@aliyun.com）

（2015-11-26）