丹參酮ⅡA對大鼠梗死心肌組織中ANG-TGF-PN信號通路的干預作用*

汪德坤　魏漢維　彭　戩（湖北省武漢市東湖醫院，湖北 武漢 430074）

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丹參酮ⅡA對大鼠梗死心肌組織中ANG-TGF-PN信號通路的干預作用*

汪德坤魏漢維彭戩
（湖北省武漢市東湖醫院，湖北 武漢 430074）

目的 觀察丹參酮ⅡA對梗死后心力衰竭模型鼠梗死組織中ANG-TGF-PN信號通路的干預作用。方法 采用通過結扎冠狀動脈（左前降支）建立的梗死后心力衰竭大鼠模型，丹參酮ⅡA用藥4周后，檢測血清中AngⅡ的水平；檢測梗死組織中轉化生長因子-β1（TGF-β1）和骨膜蛋白（PN）的表達。結果 1）心衰對照組血清中AngⅡ水平的表達較正常組顯著增加（P＜0.05）；與心衰對照組比較，3個劑量的治療組均顯著降低（P＜0.05）；大、中劑量組比雷米普利組顯著降低（P＜0.05）；而小劑量組與雷米普利組下降程度接近（P＞0.05）。2）大、中劑量組TGF-β1和PN的蛋白表達被有效抑制（P＜0.05），其中大劑量組與雷米普利組差異無統計學意義（P＞0.05），顯著低于小劑量組和心衰對照組（均P＜0.05），呈劑量依賴性。3）與心衰對照組比較，大劑量、中劑量組左室重量指數、梗死范圍、CVF和PVCA明顯降低（P＜0.05），其中大劑量組與雷米普利組無明顯差異（P＞0.05），顯著低于小劑量組（P＜0.05）。結論 丹參酮ⅡA可以通過AngⅡ-TGF-β1-PN信號通路，最終降低PN蛋白的表達，延緩大鼠心梗后心衰的發展，改善心室的重構。

心力衰竭血管緊張素Ⅱ轉化生長因子-β1骨膜蛋白丹參酮ⅡA心室重構

【Abstract】Objective：To observe the intervention effect of sodium tanshinoneⅡA sulfonate on ANG-TGF-PN signal pathways in infarction tissue of rats with heart failure.Methods：Rat models with heart failure after myocardial infarction were established byligating left anterior descending coronary artery.After treated by sodium tanshinoneⅡA sulfonate for 4 weeks，serum AngⅡlevel and the expression of TGF-β1 and PN in Infarction tissue were be detected.Results：1）Compared with the normal group，the level of AngⅡin serum increased significantly in the control group（P<0.05）；compared with the control group，that in the three treatment groups with different doses obviously dropped（P<0.05）；the level of high doses and middle dose group decreased significantly than that of Ramipril group（P<0.05）；and the levels of small dose group was similar to that of Ramipril group（P> 0.05）.2）The expression of TGF-β1 and PN was effectively inhibited in high doses and middle dose group（P< 0.05），and there was no significant difference between high dose group and Ramipril group（P>0.05），but was significantly lower than that in low-dose group and the control group（P<0.05），which showed a dose dependence. 3）compared with the control group，left ventricular mass index，the infarct size，collagen volume fraction and perivascular collagen area decreased obviously in high dose and middle dose group（P<0.05），and there was no significantly difference between the high dose group and Ramipril group（P>0.05），but was significantly lower than that in low dose group（P<0.05）.Conclusion：Sodium tanshinoneⅡA sulfonate can reduce PN protein expression by AngⅡ-TGF-β1-PN signal path，delay the development of heart failure，and improve ventricular remodeling.

【Key words】Heart failure；AngiotensinⅡ；Transforming growth factor-β1；Periostin；Sodium tanshinoneⅡA sulfonate；Ventricular remodeling

心肌梗死引起的心肌修復可分為兩個過程：炎癥階段和梗死心肌疤痕重塑階段；由疤痕組織代替梗死的心肌組織，同時伴隨細胞基質的重構，在梗死后心衰的左室重構中發揮重要作用。其中腎素-血管緊張素系統［1］（RAS）為作用通路，主要通過血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導轉化生長因子-β1（TGF-β1）的生成，從而調節了骨膜蛋白［2］（PN）的表達，刺激心肌纖維細胞和細胞間基質的的增殖，促進膠原的成熟，進行有效重構。因此對ANG-TGF-PN信號通路的調節應成為心衰后梗死組織治療的重要靶點。丹參酮ⅡA具有抑制RAS、抗心肌重構等作用［3］，本研究將設置陽性對照，分析血清中AngⅡ的濃度、TGF-β1和PN蛋白表達，研究其在大鼠梗死后心衰的左室重構中的作用機制，為臨床應用提供理論基礎。現報告如下。

1　材料與方法

1.1動物模型及實驗分組1）動物模型：90只健康Wistar大鼠（合格證號SCXK（蘇）2008-0005），雄性，清潔級，體質量（200±25）g，采用冠狀動脈（左前降支）結扎的方法制備梗死后心衰大鼠模型［4］，4%水合氯醛進行麻醉，迅速打開胸廓，充分暴露心臟滿意，在左心耳下方約2 mm處用6/0線結扎冠狀動脈 （左前降支），快速關閉胸腔并進行縫合，有效復蘇動物，術后預防感染［青霉素24萬U/（kg·d），共3 d］，飼養4周。造模成功的判斷標準：于4周末，隨機選取1只做病理學觀察，在光學顯微鏡下觀察心肌組織。造模組和正常大鼠水合氯醛麻醉滿意后，進行超聲心動圖檢查，記錄左室射血分數（LVEF）、收縮期末徑（LVESD）、左室短軸縮短率（FS）及左室舒張期末徑（LVEDD），造模組與正常大鼠差異有統計學意義。綜合光鏡病理學觀察和超聲心動圖檢查，判定造模是否成功。2）實驗分組：隨機從造模成功的大鼠中選取50只，分為5組，各10只，包括：心衰對照組（M組）、雷米普利陽性對照組（10 mg/kg，L組）、高劑量丹參酮ⅡA組（用量為0.4 mL/kg，HQ組）、中劑量丹參酮ⅡA組（用量為0.2 mL/kg，MQ組）、低劑量丹參酮ⅡA組（用量為0.1 mL/kg，LQ組），上述的藥物均完全溶于0.9%氯化鈉注射液中腹腔注射，心衰對照組每日僅0..9%氯化鈉注射液1 mL腹腔注射。再選10只正常大鼠（未造模，與造模組等量的0.9%氯化鈉注射液腹腔注射，每周1次，連續注射6周）為正常對照組（N組）。所有實驗大鼠均分籠飼養，自由飲食，喂藥過程中無大鼠死亡。

1.2試劑丹參酮ⅡA磺酸鈉（上海第一生化藥業有限公司，國藥準字Z20026249），雷米普利（北京安萬特制藥有限公司，國藥準字H20060766），AngⅡELISA試劑盒［尚柏生物醫學技術（北京）有限公司］，Western-Blot試劑（美國sigma公司），Real-timePCR、Superscript First Strand、Trizol試劑盒（日本Takara公司），TGF-β1抗體試劑（美國Abcam公司），PN抗體試劑（美國Abcam公司），TGF-β1和PN引物（上海生工生物技術公司合成）。

1.3標本采集及指標檢測用藥4周后，采股動脈血檢測AngⅡ（取血清），稱量大鼠體質量后處死各組大鼠，取左心室稱重后-80℃液氮保存，用于相關組織中TGF-β1和PN的蛋白水平的表達檢測（取心肌的梗死組織）。1）血清中AngⅡ水平的檢測：取大鼠股動脈采血2 mL，離心分離血清，使用AngⅡ定量檢測試劑盒，按照試劑盒的操作流程檢測各組大鼠血清中AngⅡ水平。2）心梗區組織相關蛋白表達的Western Blot檢測：提取各組組織的總蛋白，將蛋白上清液進行蛋白定量測蛋白濃度，配制10%SDS-PAGE凝膠，進行各孔蛋白上樣（根據所測的蛋白濃度，各孔上樣總蛋白量是相等）。電泳儀電泳，電轉儀轉膜，5%脫脂奶粉封閉1～2 h，PBS洗滌3～4次。分別孵育鼠抗-TGF-β1單克隆抗體（1∶200）和兔抗-PN單克隆抗體 （1∶1000），4℃過夜，PBS洗滌3次后分別加入相應二抗，室溫孵育1 h，PBS洗滌3～4次。洗膜后電化學發光曝光硅影，采用Image J軟件分析條帶灰度值。實驗重復3次。3）梗死面積和左心室重量指數測定：用藥4周后，分別稱量大鼠體質量以及左心室質量，以左心室質量與大鼠體質量之比計算左心室質量指數；取左心室截面心肌制作2 mm切片，置于1%TTC磷酸鹽緩沖液中，37℃水浴20 min，10%甲醛固定；采用計算機圖像分析系統計算梗死面積百分比 （IS），IS=［（疤痕外周弧長+疤痕內周長）/（左心室心外膜周長+左心室心內膜周長）］× 100%。4）膠原容積分測定：切取厚度為2 mm的左心室截面，4%甲醛固定24 h，石蠟包埋，5 μm切片，行Masson染色，通過測量選定區域染色組織的面積，計算心肌膠原容積分數 （CVF）及血管周圍膠原面積（PVCA），取其均值。其中CVF=心肌膠原面積/心肌組織總面積×100%；PVCA=血管周圍膠原面積/血管管腔面積×100%。

1.4統計學處理應用SPSS16.0統計軟件處理。計量資料以（±s）表示，組間比較用方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1各組血清中AngⅡ水平表達的比較見表1。心衰對照組血清中AngⅡ水平表達較正常對照組顯著增加（P<0.05）；與心衰對照組比較，3個劑量的治療組均顯著降低（P<0.05）；大劑量、中劑量組比雷米普利組顯著降低（P<0.05）；而小劑量組與雷米普利組下降程度接近（P＞0.05）。

表1　各組大鼠ANG-TGF-PN信號通路相關指標比較（±s）

表1　各組大鼠ANG-TGF-PN信號通路相關指標比較（±s）

與正常對照組比較，*P＜0.05；與心衰對照組比較，★P＜0.05；與雷米普利陽性對照組比較，△P＜0.05。下同。

組別n　PN正常對照組　10　0.6±0.2★△心衰對照組　10　4.6±0.5*△雷米普利陽性對照組　10　1.1±0.2*★AngⅡ（pg/mg）　TGF-β1 87.4±21.1★△　0.3±0.05★△146.3±18.2*△　1.6±0.2*△106.4±17.5*★　0.7±0.2*★高劑量丹參酮ⅡA組　10　1.2±0.2*★90.3±14.1*★△　0.8±0.1*★中劑量丹參酮ⅡA組　10　97.6±19.2*★△　1.2±0.1*★△　1.6±0.3*★△低劑量丹參酮ⅡA組　10　109.2±15.4*★　1.3±0.1*★△　2.5±0.4*★△

2.2Western Blot檢測各組心肌梗死組織內TGF-β1蛋白表達變化的比較見表1，圖1。與心衰對照組比較 ，TGF-β1的蛋白表達被大劑量、中劑量組有效抑制（P<0.05），其中大劑量組與雷米普利陽性對照組差異無統計學意義（P＞0.05），顯著低于小劑量組和心衰對照組（P<0.05），呈劑量依賴性。

圖1各組大鼠心肌梗死組織內TGF-β1蛋白水平的表達

2.3Western Blot檢測各組心肌梗死組織內PN蛋白表達的比較見表1，圖2。與心衰對照組比較 ，PN的蛋白表達被大劑量、中劑量組有效抑制，差異有統計學意義（P<0.05），其中大劑量組與雷米普利組差異不明顯（P＞0.05），顯著低于小劑量組和心衰對照組（均P< 0.05），呈劑量依賴性。

圖2　各組大鼠心肌梗死組織內PN蛋白水平的表達

2.4各組大鼠左室質量指數及梗死范圍比較見表2。與心衰對照組比較，大劑量、中劑量組左室質量指數和梗死范圍明顯降低（P<0.05），其中大劑量組與雷米普利組無明顯差異（P＞0.05），顯著低于小劑量組和心衰對照組（均P<0.05），呈劑量依賴性。

表2　各組大鼠左室質量指數、梗死范圍比較（±s）

表2　各組大鼠左室質量指數、梗死范圍比較（±s）

組別　n正常對照組　10心衰對照組　10雷米普利陽性對照組　10左室質量指數（mg/g）　IS（%）2.2±0.1★△4.4±0.2*△　39.8±2.4*△3.3±0.1*★　33.5±2.0*★高劑量丹參酮ⅡA組　10　3.2±0.2*★　32.8±2.1*★中劑量丹參酮ⅡA組　10　3.6±0.2*★△　35.4±1.7*★△低劑量丹參酮ⅡA組　10　4.1±0.2*★△　37.0±1.2*★△

2.5各組心肌纖維化相關指標比較見表3。與心衰對照組比較，大劑量、中劑量組CVF和PVCA明顯降低（P<0.05），其中大劑量組與雷米普利組差異無統計學意義 （P＞0.05），顯著低于小劑量組和心衰對照組（均P<0.05），呈劑量依賴性。

表3　各組大鼠心肌纖維化相關指標比較（%，±s）

組別　n正常對照組　10心衰對照組　10雷米普利陽性對照組　10 CVF　PVCA 3.2±0.2★△　1.3±0.1★△6.5±0.3*△　2.8±0.3*△5.1±0.2*★　1.7±0.1*★高劑量丹參酮ⅡA組　10　5.0±0.2*★　1.7±0.1*★中劑量丹參酮ⅡA組　10　5.6±0.2*★△　2.0±0.1*★△△低劑量丹參酮ⅡA組　10　6.0±0.2*★△　2.4±0.1*★△△

3　討　論

心梗通過重構心室，對心臟的形狀、大小和功能進行改變，最終導致心力衰竭，在心梗后心衰中RAS的激活至關重要。其機制主要是激活局部心肌組織的RAS系統，促使 AngⅡ生成增多［1，4］，增加細胞內鈣超載，AngⅡ能夠刺激多種生長因子的表達，其中主要為TGF-β1。而PN蛋白則是由AngⅡ-TGF-β1信號通路激活后表達增加，PN蛋白通過調節成纖維細胞和心肌細胞的黏附，刺激膠原的增生和成熟，形成間質纖維化和心肌細胞肥厚，最終導致左室重構。

本研究證實，梗死后心衰大鼠造模成功后，血清中AngⅡ的水平較正常組顯著升高，大、中劑量丹參酮ⅡA組和雷米普利組可以使之顯著降低，其中大劑量丹參酮ⅡA組比雷米普利組抑制血清中AngⅡ的水平更顯著。以往研究已證實：除經典途徑可以生成AngⅡ外，還存在其他途徑可以使AngⅠ轉化為AngⅡ，而不依賴血管緊張素轉換酶的刺激，如：肽鏈內切酶和胃促胰酶等［5］。因此某種調節途徑中，單獨使用血管緊張素轉換酶抑制劑（雷米普利）不能充分抑制生成AngⅡ，可以推測丹參酮ⅡA組能通過包括RAS系統在內的多種途徑調節AngⅡ的生成，有效防止AngⅡ生成的逃逸，且具有顯著的劑量依賴性。

TGF-β1系通過自分泌和旁分泌兩種方式生成的一種細胞因子，主要調節心臟的重構和修復過程［2，6］。本研究證實，心梗后，TGF-β1蛋白表達均顯著升高，大、中劑量丹參酮ⅡA組和雷米普利組可以使之顯著降低，其中大劑量丹參酮ⅡA組與雷米普利組效果相近，且具有顯著的劑量依賴性。丹參酮ⅡA組在降低血清中AngⅡ的方面是顯著優于雷米普利組，但在降低TGF-β1方面兩者無顯著差異，其作用機制可能和血管緊張素的受體相關。

PN是AngⅡ-TGF-β1信號通路的下游產物，系一種可溶性分泌型基質蛋白 （由838個氨基酸編碼構成），與多種類型的膠原蛋白質結合，參與膠原的生成和成熟化，PN在成年正常心肌組織中是不表達的，但在心臟受損和病變時會大量分泌表達，可以趨化心肌的成纖維細胞及合成基質蛋白，在心衰重構心室中起重要作用［2，7-15］。本研究證實，心梗后心衰大鼠造模后，PN蛋白表達均顯著升高，藥物組顯著降低，其中大劑量丹參酮ⅡA組與雷米普利組效果相近，且具有顯著的劑量依賴性。

而通過對模型大鼠的形態學、梗死面積以及左心室纖維化重構的研究也發現，心梗模型大鼠的左室重量指數、梗死范圍、CVF和PVCA均能被丹參酮ⅡA明顯改善。因此，本研究證實，丹參酮ⅡA可能是通過降低AngⅡ-TGF-β1-PN這個信號通路，有效延緩大鼠心梗后心衰的發展，改善左心室的良性重構，來保護心肌梗死組織的重塑。

綜上所述，丹參酮ⅡA可以通過AngⅡ-TGF-β1-PN信號通路，最終降低PN蛋白的表達，延緩大鼠心梗后心衰的發展，改善心室的重構，為該藥物的臨床應用提供有力依據，但仍有待于進一步深入探討大樣本量的實驗資料。

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Intervention Effect of Sodium TanshinoneⅡA Sulfonate on ANG-TGF-PN Signal Pathways in InfarctionTissue of Rats with Heart Failure

WANG Dekun，WEI Hanwei，PENG Jian. Donghu Hospital of Wuhan，Hubei，Wuhan 430074，China.

R285.5文獻標志碼：A

1004-745X（2016）06-0949-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.003

國家自然科學基金（30500657）；湖北省自然科學基金（211CDB196）

（2016-01-01）