固相萃取-高效液相色譜法同時測定番茄醬中4種蘇丹紅染料

陳波

(寧波市北侖區(qū)疾病預(yù)防控制中心 檢驗科，浙江 寧波 315800)

固相萃取-高效液相色譜法同時測定番茄醬中4種蘇丹紅染料

陳波Δ

(寧波市北侖區(qū)疾病預(yù)防控制中心 檢驗科，浙江 寧波 315800)

目的建立固相萃取-高效液相色譜法同時測定番茄醬中蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。方法樣品用乙腈∶三氯甲烷(v/v)=3:1提取，經(jīng)ProElut SDH固相萃取柱凈化，以乙腈和0.2%磷酸溶液為流動相，經(jīng)梯度洗脫分離，在500nm波長下進行檢測，外標法定量。結(jié)果蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ在0.1～20 μg/mL 濃度范圍內(nèi)的加標回收率在83.4%～94.6%，其相對標準偏差(RSD)為2.9%～5.4%，在0.1～20.0 mg/L范圍呈現(xiàn)良好的線性，其回歸系數(shù)大于0.999，檢出限(LOD)分別為蘇丹紅Ⅰ 4 μg/kg、蘇丹紅Ⅱ 8 μg/kg、蘇丹紅Ⅲ 4 μg/kg、蘇丹紅Ⅳ 5 μg/kg。結(jié)論該方法簡便、靈敏、重現(xiàn)性好，能滿足番茄醬中蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ殘留的檢測需要。

高效液相色譜；固相萃取；番茄醬；蘇丹紅染料

蘇丹紅是一種化學(xué)染色劑，它的化學(xué)成份中含有一種叫萘的化合物，該物質(zhì)具有偶氮結(jié)構(gòu)，主要包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4種類型。一般不溶于水，易溶于有機溶劑，由于這種化學(xué)結(jié)構(gòu)的性質(zhì)決定了它具有致癌性，對人體的肝腎器官具有明顯的毒性作用。蘇丹紅屬于化工染色劑，主要是用于石油、機油和其他的一些工業(yè)溶劑中，目的是使其增色，也用于鞋、地板等的增光。 近年來蘇丹紅染料被部分違法商家添加到食品表面著色以改善感官度[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織的國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)1995年確定，蘇丹紅屬第三類致癌物質(zhì)。如果長期大劑量攝入會增加人體致癌的危險性。歐盟國家已在1995年禁止其作為食用色素，我國在《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》中也禁止將蘇丹紅作為食品添加劑使用[2]。

番茄醬是西餐中的一種重要調(diào)味品，是增色、添酸、助鮮、郁香的調(diào)味佳品。國內(nèi)對辣椒醬中蘇丹紅染料的檢測有較多報道，但番茄醬較少。蘇丹紅的分析主要采用高效液相色譜法[3-4]、氣質(zhì)聯(lián)用法[5]、液質(zhì)聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫吸附法[6]、薄層色譜法等，這些方法有的前處理過程復(fù)雜、檢測時間長、檢測費用高、儀器設(shè)備貴，有的靈敏度低、有的檢測組分單一。固相萃取-高效液相色譜法檢測蘇丹紅染料的方法具有簡單、靈敏度高和穩(wěn)定性好等特點，能夠滿足批量樣品檢測的工作要求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器：安捷倫1260型高效液相色譜儀，包括紫外檢測器(G1314F)、四元泵(帶真空脫氣機)(G1311C)、柱溫箱(G1316A)，自動進樣器(G1329B)和Agilent色譜工作站；德國Sigma 3K-15型離心機 ；瑞士buchi R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；優(yōu)普純水儀；電子天平(Precisa公司)；氮吹儀(天津奧特塞恩斯MTN-2800D)

1.1.2 試劑：蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ對照品 (含量>99.0 %，Chem Service公司)；乙腈(美國天地公司，色譜純)、正己烷、三氯甲烷(天津四友，色譜純)；磷酸(AR)；SPE柱凈化：ProElut SDH 500 mg/6 mL(迪馬科技)，聚四氟乙烯濾膜(0.45 μm)。

蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的標準貯備液(1.0 mg/mL)：分別準確稱取0.0100 g蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ標準品于10 mL容量瓶中，分別用少量乙腈溶解后，并用乙腈定容至刻度。配制成1.0 mg/mL的標準儲備溶液，使用前逐級稀釋。

番茄醬樣品。來自于市場上購買的若干份各種品牌的番茄醬。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件：色譜柱：Agilent Eclipse-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)，0.2%磷酸(B)，梯度洗脫程序：其中A：80%；10.00 min，85%；15.00 min，100%；20.00 min，100%；21.00 min，80%，后運行時間3.00 min。流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量10 μL；檢測波長為500 nm。

1.2.2 樣品的提取：稱取10 g(精確到0.01 g)番茄醬于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈∶三氯甲烷(v/v)=3:1，勻漿，超聲5 min，10 000 r/min離心5 min，上清液移入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，殘渣用20 mL乙腈:三氯甲烷(v/v)=3:1重復(fù)提取1次，合并上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，加5 mL正己烷溶解，過ProElut SDH 蘇丹紅檢測專用固相萃取柱：用5 mL正己烷活化；加入待凈化液，棄去流出液；依次加入5 mL正己烷，5 mL 1%乙酸乙酯正己烷，棄去流出液；加入10 mL 30%乙酸乙酯正己烷，收集流出液；將洗脫液在40 ℃下減壓蒸餾近干，用乙腈溶液定容至1 mL，用0.45 μm濾膜過濾后供HPLC分析。

1.2.3 提取溶劑的選擇：蘇丹紅為油溶性的物質(zhì)，食品中蘇丹紅染料檢測的相關(guān)報道中提取溶劑通常有乙腈、丙酮和正己烷等。本研究分別選用了乙腈、正己烷、三氯甲烷、乙腈-三氯甲烷(v/v=3:1)4種提取溶劑對番茄醬中的蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ進行提取，結(jié)果顯示，乙腈-三氯甲烷(v/v=3:1)的提取效率最高。

1.2.4 凈化方法的選擇：國內(nèi)文獻報道蘇丹紅染料前處理有直接過濾膜上機，凝膠滲透色譜(GPC)[7]，中性氧化鋁固相萃取小柱[8]等。直接過濾膜上機，前處理方法簡單，但由于番茄醬中基質(zhì)復(fù)雜，提取后仍存在大量干擾物質(zhì)，影響色譜柱壽命。凝膠滲透色譜(GPC)凈化，凈化效果好，樣品潔凈無雜峰干擾，但GPC價格昂貴又需要專人維護，不易普及。中性氧化鋁固相萃取柱回收率平行結(jié)果偏差大。迪馬ProElut SDH固相萃取柱(6mL)，可保持高保留性能和重現(xiàn)性，各組分的吸附、洗脫、回收均較為理想。

1.2.5 方法標準曲線、檢出限及定量限：取4種蘇丹紅染料標準品，分別配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 mg/L的系列標準溶液。按上述色譜條件檢測，每個濃度重復(fù)3次，峰面積取平均值。得到標準溶液濃度X與峰面積Y之間的工作曲線。

1.2.6 精密度與加標回收率：在番茄醬中添加高、中、低3個濃度，每個添加水平重復(fù)測定6次，計算平均加標回收率和精密度(RSD)。

1.2.7 樣品檢測：對番茄醬樣品進行檢測得到加標色譜圖，與蘇丹紅混合標準的色譜圖比較。

2 結(jié)果

2.1 方法標準曲線、檢出限及定量限 4種蘇丹紅染料的標準溶液濃度X與峰面積Y之間的工作曲線，相關(guān)系數(shù)都在0.999以上。按本方法測定結(jié)果，以3倍信噪比(S/N)確定分析物的檢出限，10倍信噪比(S/N)為定量限。回歸方程、相關(guān)系數(shù)以及定量的限詳見表1。

表1 標準曲線及檢出限

2.2 精密度與加標回收率 平均加標回收率和精密度(RSD)，見表2。結(jié)果表明，4種蘇丹紅染料添加回收率在83.4～94.6%，相對標準偏差(RSD)為2.9%～5.4%。說明該方法具有較好的精密度和回收率，可以滿足痕量分析要求。

表2 番茄醬中蘇丹紅的加標回收率和精密度(n=6)Tab.2 The recovery and precision of tonyred in ketchup(n=6)

2.3 樣品檢測結(jié)果 對番茄醬樣品進行檢測，未檢出陽性樣品。圖1給出其中一份蘇丹紅混合標準的色譜圖1和該樣品的加標色譜圖2。

圖1 蘇丹紅混合標準色譜圖Fig.1 The standard chromatogram of tonyred

圖2 番茄醬中蘇丹紅加標色譜圖Fig.2 The chromatogram of sample-adding tonyred in ketchup

3 結(jié)論

通過優(yōu)化提取溶劑、樣品凈化等前處理建立了高效液相色譜，同時測定番茄醬中4種蘇丹紅染料的殘留量。本文建立了固相萃取-反相高效液相色譜法同時測定番茄醬中蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅Ⅳ，其靈敏度、精密度、準確度都可達到要求，可作為常規(guī)分析的檢測方法。

[1] 李勇競.高效液相色譜法快速測定辣椒醬中的蘇丹紅[J].安徽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2010，16(5)：354-356.

[2] 曹起靈，李銳，方忠意，等.超高效液相色譜法測定飼料中蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的含量[J].飼料工業(yè)，2008，29(12)：61-62.

[3] GB/T 19681—2005.食品中蘇丹紅染料的檢測方法 高效液相色譜法[S].

[4] 周建科, 劉瑞英, 李曉陽. 山楂飴中蘇丹紅的高效液相色譜法測定[J] .現(xiàn)代食品科技,2009, 25(2):208-210.

[5] 林佶，萬玉萍，沈其萍，等．GC/MS定性定量分析食品中的蘇丹紅Ⅰ號[J]．職業(yè)與健康，2006，22(22):45-46.

[6] 唐甬,據(jù)春梅,魏鐘杰,等. 蘇丹紅Ⅰ、Ⅲ和對位紅競爭ELISA檢測方法的初步建立[J].食品科學(xué),2008,29(8):523-525.

[7] 宋歡，連庚寅，杜麗君，等.凝膠滲透色譜-液相色譜法測定辣椒及其制品中的對位紅和蘇丹紅[J].食品科學(xué)，2006，27(12)：611-613.

[8] 王明月，桂衛(wèi)星，袁宏球，等.HPLC法測定咸蛋、皮蛋黃中的四種蘇丹紅染料[J].食品科學(xué)，2009,30(2)：193-195.

(編校：王儼儼)

SimultaneousdeterminationoffourkindsoftonyredinketchupbySPE-HPLC

CHEN BoΔ
(Department of Laboratory, Beilun Ningbo District Center for Disease Control and Prevention, Ningbo 315800,China)

ObjectiveTo establish simultaneous determination of tonyred Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ in ketchup by solid phase extraction-high performance liquid chromatography (SPE-HPLC).MethodsSamples were extracted by solvent of acetonitrile:trichloromethane (v/v) =3:1, and purified by ProElut SDH. The acetonitrile and 0.2% phosphoric acid solution as the mobile phase with gradient elution separation, the detection wavelength was 500nm, quantified by external standard method.ResultsTonyred I, II, III, IV recoveries in 0.1-20 g/mL concentrations ranged at the rate of 83.4%-94.6%, the relative standard deviation (RSD) ranged from 2.9% to 5.4%, showed a good linear range of 0.1-20.0 in mg/L, the regression coefficient was greater than 0.999, the limit of detection (LOD) respectively as tonyred I 4 μg/kg, tonyred II 8 μg/kg, 4 μg/kg tonyred tonyred III, IV 5 μg/kg.ConclusionThe method is simple, sensitive, reproducible, can meet the tonyred I, II, III, IV requires detection of residues.

high performance liquid chromatography; solid phase extraction; ketchup; tonyred dye

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.10.045

陳波，通信作者，女，本科，研究方向：檢驗，E-mail：chenbozj1979@163.com。

TQ617.1；R155.5+1

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