外源NO對銅脅迫下小白菜SBPase基因表達特性及其光合速率的影響

葉麗萍， 鐘鳳林， 林義章， 林琳琳

(福建農林大學園藝學院， 福州 350002)

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外源NO對銅脅迫下小白菜SBPase基因表達特性及其光合速率的影響

葉麗萍， 鐘鳳林， 林義章*， 林琳琳

(福建農林大學園藝學院， 福州 350002)

【目的】本研究通過克隆小白菜光合暗反應中限制核酮糖-1, 5-二磷酸(RuBP)再生的關鍵酶景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶(sedoheptulose-1, 7-bisphosphatase，SBPase)基因，分析銅脅迫及添加外源一氧化氮(NO)供體硝普鈉(SNP)緩解銅脅迫時該基因的表達情況，并將其與對應處理下小白菜凈光合速率(Pn)的變化情況結合在一起進行分析，以期為全面了解外源NO緩解銅脅迫植物光合作用機理提供理論依據。【方法】以小白菜品種“上海青”34片真葉大的幼苗為材料，采用RT-PCR技術克隆小白菜SBPase基因，銅處理濃度為200 μmol/L，外源NO供體SNP濃度為300 μmol/L，同時設置相關的4個對照組排除其他可能因素的干擾，在添加處理液后的0、 4、 8、 12 d上午九點測定各處理小白菜相同節位葉片的凈光合速率，并利用實時熒光定量PCR技術檢測在對應的處理時間及對應節位小白菜葉片中SBPase基因的表達情況。試驗環境條件為光照強度200 μmol/(m2·s)，光周期12 h，溫度25℃/18℃。【結果】 1)克隆得到小白菜SBPase基因(Genbank登錄號：AHY18974.1)，開放閱讀框為1182 bp，編碼393個氨基酸，蛋白質分子量為42.34kD，理論等電點為5.85。2)序列分析表明其含有氧化還原活性位點，包含一個具有59個氨基酸殘基的葉綠體轉移肽序列。小白菜SBPase基因推導的氨基酸序列與其他物種中已分離的SBPase編碼的氨基酸序列具有很高的同源性。3)實時熒光定量PCR分析表明，SBPase基因在銅脅迫下的小白菜葉片中表達量下降，且隨著脅迫時間的延長下降程度加劇；而在銅脅迫的基礎上添加外源NO可以在一定程度上緩解銅脅迫引起的小白菜葉中SBPase基因表達量的下降。4)銅脅迫下小白菜葉片Pn顯著下降，且隨著脅迫時間的延長，Pn下降加劇，施加外源NO后Pn的下降得到一定程度的緩解，各處理下Pn的變化與SBPase基因表達量變化趨勢一致。【結論】銅脅迫及在銅脅迫的基礎上添加外源NO后小白菜葉片中SBPase基因表達量的變化，可能是影響對應條件下小白菜葉片的凈光合速率變化的原因之一。

小白菜； 銅脅迫； 一氧化氮； 景天庚酮糖-1, 7-二磷酸酶； 實時熒光定量PCR

光合作用是植物生長發育的基礎，它的強弱對于植物的生長、 產量及抗逆性有著重要的影響。光合暗反應又稱為卡爾文循環，是高等植物碳固定的基本途徑，其反應過程由RuBP為起點至RuBP再生結束。景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶(sedoheptulose-1, 7-bisphosphatase)是限制光合作用卡爾文循環中RuBP再生速率的關鍵酶，也是植物光合作用途徑的主要限速酶之一[1]。CO2受體RuBP由景天庚酮糖-7-磷酸轉變而來，景天庚酮糖-7-磷酸由SBPase酶不可逆地催化景天庚酮糖-1，7-二磷酸去磷酸化生成[2]。前人研究表明[3-5]，將SBPase基因反向導入煙草中，發現SBPase活性的微小下降即可導致反義轉基因植株碳同化速率的顯著下降，植株生長受到抑制。Lawson等[6]研究表明，當SBPase活性或SBPase基因表達量下降時，植物的光合能力，生長速度以及生物量的積累均下降。可見SBPase酶對光合作用強弱起著重要的調控作用。

銅是植物生長發育所必需的微量元素，但是過量的銅卻會對植物產生毒害作用[7]。近年來隨著農業生產上含銅殺菌劑的頻繁使用、 銅礦的過度開采及工業生產中含銅污染物的大量排放，使得土壤中的銅含量越來越高，影響著蔬菜的品質和產量[8-11]。植物受到銅脅迫后葉綠體結構發生明顯變化，光合速率明顯下降[12]。外源NO是一種生物活性氣體分子[13]，研究表明其在保護植物抵抗重金屬毒害等非生物脅迫引起的植物光合作用的下降方面有著重要的作用[14-16]。

目前，關于外源NO緩解銅脅迫下植物光合作用的相關研究主要集中在植物形態及生理生化指標變化方面，研究表明[14, 17-18]施加適宜濃度的外源NO可以顯著提高番茄、 玉米、 黃瓜、 油菜在銅、 鎘脅迫下的凈光合速率，但關于外源NO對銅脅迫下植物光合碳同化過程重要酶對應基因的表達是否產生影響，及其變化情況與光合作用變化的對應關系研究較少。小白菜(BrassicachinensisL.)為十字花科蕓薹屬蔬菜，營養豐富、 味道鮮美，適應性強，四季均有，栽培周期短，廣泛栽培，備受人們喜愛。本研究以小白菜為試驗材料，克隆小白菜的SBPase基因序列，并研究外源NO對銅脅迫下小白菜SBPase基因表達量的變化與小白菜光合速率的對應關系的影響，為全面了解外源NO緩解銅脅迫植物光合作用機理提供一定的理論依據。

1　材料與方法

1.1試驗材料

試驗在福建農林大學園藝學院溫室內進行。供試小白菜品種為“上海青”，采用穴盤育苗，待幼苗長到34片真葉時，選取生長一致、 健壯的幼苗將其移至裝有12 L通用葉菜類水培營養液的塑料盆中，每盆18株，緩苗5 d后移入處理液中。NO供體SNP購自Sigma公司。處理條件為光照強度200 μmol/(m2·s)、 光周期12 h、 溫度25℃/18℃。

1.2試驗設計

試驗共設6個處理： 1)對照，完全營養液(CK)； 2)200 μmol/L CuSO4·7H20(Cu)； 3)200 μmol/L CuSO4·7H20+300 μmol/L SNP(Cu+S)； 4)200 μmol/L CuSO4·7H20+ 300 μmol/L NaNO2+300 μmol/L NaNO3(Cu+N)； 5)200 μmol/L CuSO4·7H20 +300 μmol/L K3[Fe(CN)6](Cu+F)； 6)200 μmol/L CuSO4·7H20 + 300 μmol/L SNP+25 μmol/L Nitro-L-arginine(NO抑制劑)(Cu+S+L)。每個處理設3次重復，每4 d更換一次營養液(每次取樣后更換營養液)，在處理后的0、 4、 8、 12 d上午九點測定各處理植株第3片完全展開的功能葉的凈光合速率，并取相同節位的功能葉用液氮速凍后保存于-80℃的冰箱中備用。

1.3測定項目與方法

1)小白菜葉片凈光合速率測定采用美國生產的CI-340便攜式光合測定儀，于上午九點測定植株第3片完全展開的功能葉的凈光合速率(Pn)。

2)小白菜葉片總RNA提取與cDNA合成采用Trizol法提取小白菜葉片總RNA(Trizol購于Invitrogen公司)，并對所獲得的總RNA進行電泳檢測和OD值的測定。利用RevertAit First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(Thermo公司)，將所提取的質量較高的RNA反轉錄成cDNA，作為模板。

3)SBPase基因的克隆 RT-PCR引物序列為，SBPaseF： 5′-ATGGAGACCAGCATCGCGTGCT-3′；SBPaseR： 5′-AGTTTCTAAGCGGTAACTCC-3′。

RT-PCR反應體系為：反應體系為1 μL cDNA、 1 μLSBPaseF、 1 μLSBPaseR、 2.5 μL 10×Ex-taqbuffer、 0.2 μL Ex-Taq(5U/μL)、 0.5 μL dNTP(10 mmol/L)、 加ddH2O至體積25 μL。RT-PCR反應步驟： 94℃ 5 min； 94℃ 45 s，52℃ 40 s，72℃ 75 s，共35個循環； 72℃ 10 min。

4)SBPase基因的生物信息學分析利用相關軟件分析小白菜SBPase編碼的氨基酸序列，即用Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 進行同源序列搜索；用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)預測基本的理化性質；用ProScal (http://web.expasy.org/protscale/) 默認算法(Hphob./Kyte&Doolittle)預測該蛋白的疏水性；用SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 預測信號肽；應用DNAMAN進行序列比對；用MEGA5.2構建系統進化樹。

5)SBPase基因的特異性表達分析分別提取處理0、 4、 8、 12 d的小白菜葉片總RNA，控制用于逆轉錄的RNA起始濃度相同，用SuperscriptTMШ First-Strand cDNA Synthesis System for RT-PCR試劑盒合成cDNA。利用小白菜actin為內參基因(引物為actin-qF5′-GTCCTGTTCCAGCCTTCGTTC-3′，actin-qR5′-CAAG TCCTTCCTGATATCCACGTC-3′)。根據已得到的小白菜SBPase基因的ORF序列設計qRT-PCR特異性引物(SBPase-qF：5′-AGGTGGGTTTAGT GTGGCATTTG -3′，SBPase-qR：5′-CTTGATCTCC TCCCGTGACTCC -3′)。用SYBR Premix ExTaq試劑盒進行qRT-PCR檢測該基因在不同處理、 相同處理不同處理時長的表達情況。

qRT-PCR反應體系為： 1 μL cDNA、 0.4 μL上游引物、 0.4 μL下游引物、 10 μL SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)、 加ddH2O2至體積20 μL。Real-time PCR反應步驟采用兩步法，95℃ 10 min， 95℃ 15 s， 58℃ 30 s(回到第二步共40個循環)。

2　結果與分析

2.1外源NO對銅脅迫下小白菜葉片凈光合速率的影響

2.2SBPase基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技術獲得SBPase基因開放閱讀框的cDNA序列(圖2)，長為1182bp(GenBank 登錄號：AHY18974.1)，推測其編碼393個氨基酸，含有起始密碼子ATG和終止密碼子TAG(表1)。

2.3生物信息學分析

用ProtParam軟件預測結果顯示，小白菜SBPase基因編碼的蛋白質分子量為42.34 kD，理論等電點為5.85，所帶的正電荷總數(Arg+Lys)為39，負電荷總數(Asp+Glu)為43為堿性蛋白。理論推導半衰期是30 h，不穩定指數為34.19，為穩定蛋白。

圖1　外源NO對銅脅迫下小白菜葉片凈光合速率的影響Fig.1　Effects of exogenous nitric oxide on the net photosynthetic rate in leaves of Brassica chinensis L. under the copper stress[注(Note): 柱上不同字母表示處理間差異達5%顯著水平Different letters above the bars mean significant difference at the 5%level.]

序號SBPase基因核苷酸序列及推導的氨基酸序列

圖2　SBPase基因ORF區段擴增結果Fig.2　Amplification product of SBPase[注(Note): M—DL2000; A—SBPase]

利用Expasy對蛋白質親水性、 疏水性進行分析，結果顯示，疏水性氨基酸占42.44%，親水性氨基酸占57.56，該蛋白為親水性蛋白。由圖3可以看出，在圖中所有的SBPase氨基酸序列中，有5個Cys是保守的，其中的2和3形成CGGTAC結構，這一結構被認為是很多酶的氧化還原活性位點，參與光的調節反應[19-20]。由圖3還可以發現，不同植物的SBPase氨基酸序列的N-末端同源性較低，但它們都具有葉綠體蛋白轉移肽的共同特征，即含有較多的絲氨酸，較少的天冬氨酸、 谷氨酸。利用ChloroP 1.1 Prediction Server分析發現，由小白菜SBPase基因推導的氨基酸序列含有一個包含59個氨基酸殘基的葉綠體轉移肽序列，這與前人的研究結果一致[2, 21]。

圖3　小白菜SBPase基因推測的氨基酸序列與其他植物中該序列的同源性比對Fig.3　Alignment of amino acid sequence of Brassica chinensis L. SBPase with other species[注(Note): NP 001267658.1—黃瓜Cucumis sativus; XP 006355654.1—馬鈴薯Solanum tuberosum; NP 191139.1—擬南芥Arabidopsis thaliana; XP 002263049.1—葡萄Vitis vinifera; AHY18974.1—小白菜 Brassica chinensis L.]

將小白菜SBPase編碼的蛋白與GenBank中登錄的12個物種的SBPase蛋白進行聚類分析，構建SBPase進化樹。結果如圖4所示，小白菜SBPase推測的氨基酸序列與同為十字花科的擬南芥SBPase的親緣關系最近，同源性為95.67%。同玉米的SBPase的親緣關系最遠，同源性為73.75%。

圖4　小白菜SBPase氨基酸序列與其他物種SBPase氨基酸序列的系統進化樹分析 Fig.4　Phylogenetic tree of amino acid sequences of Brassica chinensis L. SBPase with other species

圖5　外源NO對銅脅迫下小白菜葉片中SBPase基因表達的影響Fig. 5　Effects of exogenous nitric oxide on the expression of SBPase in leaves of Brassica chinensis L. under the copper stress[注(Note): 柱上不同字母表示差異達5%顯著水平Different letters above the bars mean significant difference at the 5%level.]

2.4外源NO對銅脅迫下小白菜葉片中SBPase基因表達特性的影響

由圖5可以看出，200 μmol/L的銅處理小白菜，脅迫4 d時小白菜葉片中SBPase基因的表達量顯著下降，且隨著處理時間的延長小白菜葉片中SBPase基因的表達量下降程度加劇，而在銅脅迫的基礎上同時外施300 μmol/L的SNP處理(Cu+S)，能提高銅脅迫下小白菜葉片SBPase基因的表達量，但其表達量仍低于對照處理。在添加NO抑制劑處理后(Cu+S+L)，SNP的緩解效果被消除。在銅處理液中加入300 μmol/L NaNO2/NaNO3(Cu+N)或300 μmol/L K3[Fe(CN)6](Cu+F)，與只添加銅脅迫處理的差異不顯著。說明外源NO可以在一定程度上緩解銅脅迫引起的小白菜葉片中SBPase基因表達量的下降。

3　討論

前人研究表明，在煙草、 番茄、 水稻中SBPase基因表達量下降及酶活下降時，其凈光合能力、 生長速度及生物量的積累都會明顯下降[3-6]，表明SBPase基因表達量及酶活的變化會對植物光合作用的變化產生相應的影響。Wang等[15]研究表明低溫脅迫下，番茄葉片的SBPase基因表達量及SBPase酶活性降低，且番茄葉片的Pn出現同樣的變化趨勢，表明部分非生物脅迫引起的植物葉片中的SBPase基因表達量下降，是植物在對應脅迫下光合速率下降的原因之一。本研究結果表明，銅脅迫4 d就會引起小白菜葉片中的SBPase基因表達量出現顯著的下降，且隨著脅迫時間的延長，SBPase表達量下降加劇；在銅脅迫4 d時小白菜葉片的Pn也降低，且隨著脅迫時間的延長Pn下降加劇，即小白菜受到銅脅迫時SBPase表達量與Pn的值均呈下降趨勢。在銅脅迫的基礎上施加適宜濃度的SNP處理后小白菜葉片的SBPase的表達量增加，且小白菜葉片中Pn也出現同樣的升高趨勢。崔金霞[22]研究也表明適宜濃度的SNP處理，可以提高黃瓜葉片中多個參與卡爾文循環過程的酶對應基因的表達水平。本研究結果表明小白菜葉片中SBPase表達量的變化可能是引起小白菜在銅脅迫及銅脅迫的基礎上添加外源NO時小白菜葉片凈光合速率出現相應的降低或升高的原因之一。

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Effects of exogenous nitric oxide onSBPasegene expression characteristics and photosynthetic rate ofBrassicachinensisL. under copper stress

YE Li-ping, ZHONG Feng-lin, LIN Yi-zhang*, LIN Lin-lin

(CollegeofHorticulture,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China)

【Objectives】 In order to provide a theoretical basis for comprehensive understanding mechanism of adding exogenous nitric oxide(NO) to alleviate the decline of net photosynthetic rate(Pn), the gene of sedoheptulose-1, 7-bisphosphatase (SBPase) which is one of the key enzymes to restrict RuBP regeneration in calvin cycle was cloned, and the different expression of theSBPasegene inBrassicachinensisL. leaves under copper stress and adding theSNPwas analyzed combined with the net photosynthetic rate changes. 【Methods】 TheSBPasegene ofBrassicachinensisL. was cloned by RT-PCR, and seedlings ofBrassicachinensisL. (named Shanghai green) with three to four real leaves were used as materials. Copper concentration was 200 μmol/L, and the SNP concentration was 300 μmol/L. At the same time, four related groups were set to exclude the disruptive factors. The Pn and the expression ofSBPasegene ofBrassicachinensisL. leaves at the same position and moment after the treatment of 0, 4, 8 and 12 days were determined. The environmental conditions of the experiment were light intensity, 200 μmol/(m2·s); photoperiod, 12 h; and temperature, 25℃/18℃.【Results】1) The sequence of the open reading frame ofSBPase gene is 1182bp, encoding 393 amino acids. The molecular weight of the predicted protein is 42.34kD and the theoretical isoelectric point is 5.85. 2) The sequence analysis show that it contains a redox active site and a 59-amino acid chloroplast transfer peptide. The amino acid sequence has high homology with other SBPase separated from other species. 3) The qRT-PCR analysis show that theSBPasegene expression inBrassicachinensisL.leaves is declined under copper stress, and with time extending the degree of decline is aggravated. Besides, the expression ofSBPasegene is increased after the addition of NO. 4) The application of exogenous NO increases the Pn ofBrassicachinensisL. leaves under the copper stress, and the variation tendency of Pn and the expression ofSBPasegene are in a good agreement. 【Conclusions】The expression ofSBPasegene inBrassicachinensisL. leaves is changed under the copper stress and the addition of NO, which may be one of the causes of the change of Pn inBrassicachinensisL. under the copper stress and the addition of NO.

BrassicachinensisL.; copper stress; NO; sedoheptulose-1,7-bisphosphatase; real-time PCR

2014-12-08接受日期： 2015-05-28網絡出版日期： 2015-09-29基金項目: 福建省大宗蔬菜產業體系(2012K83139294)； 福建省自然科學基金(2012j01082)； 福建農林大學校重點建設項目(6112c0409)資助。

葉麗萍(1989—)， 女， 福建浦城人， 碩士研究生， 主要從事蔬菜遺傳育種方面的研究。 E-mail: yeliping1202@163.com

E-mail: lyz2003007@163.com

S634.3.601； Q945.78

A

1008-505X(2016)03-0736-08