復方中藥混菌發酵制劑對AA肉雞紅細胞免疫功能的影響

張桂枝，邢啟銀，靳雙星

（河南牧業經濟學院畜牧工程系，河南 鄭州 450046）

復方中藥混菌發酵制劑對AA肉雞紅細胞免疫功能的影響

張桂枝，邢啟銀，靳雙星

（河南牧業經濟學院畜牧工程系，河南 鄭州 450046）

為考察復方中藥混菌發酵制劑對AA肉雞免疫功能的影響，試驗選取健康AA肉雞400只，隨機分成5組，每組設5個重復。試驗雞在新城疫活疫苗（LaSota株）免疫時分別應用復方中藥制劑和復方中藥混菌發酵制劑連用7 d，并于14、28日齡分別進行白細胞、淋巴細胞計數和測定T－淋巴細胞陽性率、免疫器官指數及新城疫抗體效價等免疫指標。結果與空白對照組相比，復方中藥混菌發酵制劑可顯著或極顯著提高雞的白細胞、淋巴細胞數量，T-淋巴細胞陽性率、免疫器官指數和新城疫抗體水平（P<0.05或P<0.01）;與藥物對照組相比，復方中藥混菌發酵制劑中、高劑量組可顯著提高淋巴細胞數量、免疫器官指數和新城疫抗體水平（P<0.05），復方中藥混菌發酵制劑用藥劑量可以減半使用。表明復方中藥混菌發酵制劑能顯著地促進肉雞淋巴細胞的增殖、免疫器官發育和疫苗抗體的產生，增強機體的免疫功能。

復方中藥；發酵；肉雞；免疫

中草藥及其制劑因其具有安全、高效、低毒、價廉、不易產生耐藥性等優點，在動物疫病防控中發揮著越來越大的作用[1-2]。近年來，通過微生物發酵手段炮制中藥的研究越來越受到重視，并取得了一定進展。應用微生態菌發酵中藥，可集發酵中藥制劑和微生態制劑雙重功能，其臨床效果優于常規微生物發酵制劑和單一的中藥制劑，是現代生物技術和中藥研究的完美結合，成為中藥的研究與開發的新熱點。因此，本課題組成員根據中獸醫理論及養殖業生產實際需要科學組方，研制出復方中藥混菌發酵制劑。為進一步闡明它增強免疫作用的機制，通過在飼料中添加不同劑量的復方中藥混菌發酵制劑，測定AA肉雞的免疫細胞數量、免疫器官臟器指數、疫苗免疫后抗體效價等變化規律，探討復方中藥混菌發酵制劑對AA肉雞免疫功能的影響，旨在為臨床應用及生產實踐提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗樣品復方中藥制劑：由連翹、黃芪、板藍根、茯苓、白術、枳實、山楂、甘草等8味中藥組成。分別于50℃～60℃下烘干2～3 h，粉碎，100%過80目篩，備用。復方中藥混菌發酵制劑：取上述復方中藥制劑調整物料含水量為50%，pH值為6.0左右，使枯草芽孢桿菌：產朊假絲酵母：嗜酸乳桿菌=1∶1∶1，混勻后，按4%接種量接入飼料中，攪拌均勻后裝入不透氣的塑料袋中，壓實，封口，置于31℃的環境中培養72 h，烘干，即得。

1.2試驗動物與設計1日齡健康AA肉雞，隔離飼養至7日齡，選取400只體重相近健康的肉仔雞，隨機分為5組，每組設5個重復，每個重復16只雞，分籠飼養，自由采食和飲水，試驗期間各組飼養管理條件一致。Ⅰ組為空白對照組，不用藥；Ⅱ組為復方中藥制劑組，飼料中添加1%復方中藥制劑，為藥物對照組；試驗Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組，在飼料中分別添加0.5%、1.0%、1.5%的復方中藥混菌發酵制劑。分別于免疫前1d用上述藥物，連續用藥1周。免疫程序：5組雞均在7日齡1.5倍量點眼滴鼻接種新城疫活疫苗（LaSota株）；21日齡3倍量飲水接種新城疫活疫苗（LaSota株）。

1.3主要試劑雞淋巴細胞分離液（天津灝洋生物制品有限公司生產）。新城疫（ND）標準濃縮抗原、ND標準陽性血清（購自中國獸醫藥品監察所）。雞新城疫活疫苗（LaSota株）（齊魯動物保健品有限公司）。

1.4主要儀器顯微鏡、恒溫培養箱、離心機、微型振蕩器、96孔V型反應板、微量移液器等。

1.5檢測指標及測定方法

1.5.1白細胞分類計數采用常規方法[3]。

1.5.2T-淋巴細胞陽性率的測定采用酸性α-醋酸萘酯酶（ANAE）染色法，計算T淋巴細胞ANAE陽性細胞百分率[4]。

1.5.3免疫器官指數測定于14、28日齡，每重復隨機抽取2只體重相近健康的AA肉雞，每個處理組共選10只雞，分別稱重，頸靜脈放血致死，迅速摘取胸腺、脾臟和腔上囊，進行稱重并計算其免疫器官指數。免疫器官指數=免疫器官重量（g）/試驗階段體重（kg）。

1.5.4抗體效價測定分別在7、14、28日齡，每重復隨機抽取2只體重相近健康的AA肉雞，每個處理組共選10只雞，采血，分離血清，采用微量紅細胞凝集抑制（HI）試驗對血清樣品進行ND抗體測定，以完全抑制4個血凝單位抗原的血清最高稀釋倍數作為抗體效價，用nlg2來表示。

1.6統計分析試驗數據采用SPSS 12.0中One-Way ANOVA過程進行單因素方差分析，并進行Duncan′s多重比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準，結果以平均值±標準差表示。

2　結果與分析

2.1復方中藥混菌發酵制劑對AA肉雞白細胞總數的影響由表1可知，復方中藥制劑組和復方中藥混菌發酵制劑高、中、低劑量在14日齡、28日齡均能顯著提高其白細胞總數，即Ⅱ組、試驗Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組與對照組比較差異顯著（P<0.05）；試驗Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組與Ⅱ組比較差異不顯著（P>0.05）。試驗Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ各組之間比較差異不顯著（P> 0.05）。說明日糧中添加復方中藥混菌發酵制劑和復方中藥制劑均能顯著提高雞新城疫免疫期間的白細胞數量。

表1　復方中藥混菌發酵制劑對AA肉雞白細胞數量的影響（×109/L）

2.2復方中藥混菌發酵制劑對AA肉雞淋巴細胞數量的影響表2結果表明，復方中藥制劑組和復方中藥混菌發酵制劑高、中、低劑量在14日齡、28日齡均能顯著提高其淋巴細胞數量。藥物對照Ⅱ組、試驗Ⅲ與對照組比較差異顯著（P<0.05），試驗Ⅳ、Ⅴ組與與對照組比較差異極顯著（P< 0.01），Ⅱ組、Ⅲ組與Ⅳ、Ⅴ組比較差異顯著（P< 0.05）；Ⅱ組與Ⅲ組以及Ⅳ與Ⅴ組之間比較差異不顯著（P>0.05）。說明免疫期間以1%劑量添加復方中藥制劑和以0.5%劑量添加復方中藥混菌發酵制劑可顯著提高雞的淋巴細胞的數量；以1% 或1.5%劑量添加復方中藥混菌發酵制劑能極顯著提高肉雞的淋巴細胞的數量。

表2　復方中藥混菌發酵制劑對AA肉雞淋巴細胞數量的影響（×109/L）

2.3復方中藥混菌發酵制劑對AA肉雞T-淋巴細胞陽性率的影響由表3結果可知，復方中藥制劑組和復方中藥混菌發酵制劑高、中、低劑量在14日齡、28日齡均能顯著提高其T淋巴細胞陽性率。藥物對照Ⅱ組、試驗Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組與對照組比較差異顯著（P<0.05）；試驗Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組與Ⅱ組比較差異不顯著（P>0.05）。試驗Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ各組之間比較差異不顯著（P>0.05）。說明日糧中添加復方中藥混菌發酵制劑和復方中藥制劑均能顯著提高雞新城疫免疫期間的T-淋巴細胞陽性率。

表3　復方中藥混菌發酵制劑對AA肉雞T-淋巴細胞陽性率的影響/%

2.4復方中藥混菌發酵制劑對AA肉雞免疫器官指數的影響由表4可知，14日齡，藥物對照Ⅱ組、試驗Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組胸腺指數極顯著高于對照組（P<0.01）；Ⅳ、Ⅴ組腔上囊指數顯著高于對照組和Ⅱ、Ⅲ組（P<0.05）；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組脾臟指數顯著高于對照組（P<0.05），而Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ之間差異不顯著（P>0.05）。28日齡，試驗Ⅳ、Ⅴ組胸腺指數和脾臟指數極顯著高于對照組（P<0.01），顯著高于Ⅱ、Ⅲ組（P<0.05），Ⅱ、Ⅲ組顯著高于對照組（P<0.05）。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組腔上囊指數顯著高于對照組（P<0.05）。說明日糧中添加復方中藥混菌發酵制劑和復方中藥制劑均能顯著提高肉雞免疫器官指數。

表4　復方中藥混菌發酵制劑對AA肉雞免疫器官指數的影響　（g/kg）

2.5復方中藥混菌發酵制劑對AA肉雞新城疫疫苗免疫效果的影響由表5可知，復方中藥制劑組和復方中藥混菌發酵制劑高、中、低劑量組在7日齡免疫前新城疫抗體效價差異不顯著（P> 0.05），在14、28日齡均能顯著提高新城疫抗體效價。藥物對照Ⅱ組、試驗Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組與對照組比較差異顯著（P<0.05）；14日齡時，試驗Ⅴ組與藥物對照Ⅱ組比較差異顯著（P<0.05）。試驗Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ各組之間比較差異不顯著（P>0.05）。說明日糧中添加復方中藥混菌發酵制劑和復方中藥制劑均能顯著提高雞新城疫免疫期間的新城疫抗體效價。

表5　復方中藥混菌發酵制劑對AA肉雞新城疫疫苗免疫效果的影響　（lg2）

3　討論

3.1本復方中藥混菌發酵制劑是由連翹、板藍根、黃芪、甘草、茯苓、白術、枳實、山楂等中藥組成。黃芪、白術補中益氣，茯苓健脾利水，板藍根、連翹扶正祛邪，枳實破積行氣，山楂消食健脾，甘草調和諸藥。因此，此方具有補中益氣，健脾和胃，兼以清熱解毒、消導理氣的作用。發酵是中藥炮制的一種重要手段和方法，利用微生物強大的分解轉化物質的能力，達到提高中藥藥效、改變藥性、擴大適應癥、降低毒副作用的目的。現代藥理研究表明，方中黃芪、板藍根、茯苓、白術、甘草及連翹等都具有免疫增強作用，能顯著促進雞免疫器官的發育和免疫活性細胞的生成，并可增加血液中白細胞總數，促進嗜中性粒細胞和巨噬細胞的吞噬功能，增強細胞免疫和體液免疫[5-7]。

3.2外周血白細胞總數的變化反映了各種白細胞數量的變化，可以作為檢驗機體免疫功能變化的一個重要指標。細胞免疫應答主要依賴于T淋巴細胞[4]。本研究結果表明，復方中藥混菌發酵制劑在14、28日齡可以顯著或極顯著地提高肉雞血液中白細胞數量、淋巴細胞數量和T淋巴細胞陽性率，并維持在高水平。在復方中藥混菌發酵制劑對AA肉雞淋巴細胞數量的影響研究中發現，日糧中添加1%復方中藥制劑組與1%和1.5%復方中藥發酵制劑組相比有顯著差異，與添加0.5%復方中藥發酵制劑組相當，說明復方中藥制劑經混菌發酵后其藥效明顯增強，這可能與有益微生物利用中藥成分作為營養物質進行生長、繁殖和代謝，在此過程中分泌的蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶等胞外酶，使植物細胞壁破裂，從而利于中藥有效成分從胞內釋放有關。研究結果證明，復方中藥混菌發酵制劑具有顯著促進免疫細胞的分裂、增殖、活化作用，能加速機體細胞免疫的發育和完善。

3.3Rivas等[8]認為胸腺、脾臟、腔上囊的重量可用以評價雛雞的免疫狀態，其絕對重量和相對重量的變化可以反映機體內細胞免疫和體液免疫機能。因此，通過測定免疫器官指數，可從生長發育角度評價機體免疫狀態和免疫能力[9]。試驗結果表明，飼料中添加一定劑量的復方中藥混菌發酵制劑可顯著提高肉雞胸腺、腔上囊和脾臟指數，這與謝紅兵[10]、葛劍[11]等報道的結果基本一致。說明本復方中藥混菌發酵制劑可促進肉雞淋巴器官的生長發育和迅速成熟。比較研究結果發現，在日糧中添加1%復方中藥制劑與1%和1.5%復方中藥混菌發酵制劑組相比有顯著差異，進一步驗證了發酵可促進中藥藥效的增強。

3.4體液免疫是由抗原刺激B淋巴細胞，引起B淋巴細胞活化、增殖與分化，形成漿細胞并產生抗體，抗體效價的變化反映機體的體液免疫狀態。本試驗結果表明，復方中藥混菌發酵制劑在不同程度上提高雞血清ND抗體效價，說明該復方中藥混菌發酵制劑有明顯增強新城疫疫苗免疫效果的作用。

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S853.72

B

0529-6005（2016）07-0052-03

2015-06-02

河南省科技攻關計劃項目（142102110044）；河南牧業經濟學院科技創新團隊項目（HUAHE2015003）

張桂枝（1970-），女，副教授，碩士，從事畜禽疫病防治的教學與科研工作，E-mail：zhangguizhi666@126.com

靳雙星，E-mail：jinshuangxing@126.com