貉源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定與藥敏試驗

張召興，耿田田，李蘊玉，賈青輝，張艷英，張香齋，李佩國，史秋梅

（河北科技師范學院河北省預防獸醫學重點實驗室，河北 昌黎 066604）

貉源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定與藥敏試驗

張召興，耿田田，李蘊玉，賈青輝，張艷英，張香齋，李佩國，史秋梅

（河北科技師范學院河北省預防獸醫學重點實驗室，河北 昌黎 066604）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella Multocida）又稱多殺巴斯德菌，多殺巴斯德菌含3個亞種，屬于巴斯德菌屬，可以引起人及多種動物發病[1]。在動物的感染表現并有相應的專用疾病名稱，如豬肺疫、毛皮動物巴氏桿菌病等[2]。于愛紅等[3]報道了該菌導致人手術切口感染。可以導致人的不同器官感染[4]。該病原菌發生無明顯季節性、環境條件、飼養條件改變等不良因素致使機體的抵抗力下降，促進病原菌大量增殖并引起發病[5]，造成嚴重的經濟損失。

近幾年，毛皮動物狐、貉、貂的細菌病種類多、血清型復雜，尤其是呼吸道性疾病往往與其他細菌混合感染[6]。貉的巴氏桿菌病未見報道。本試驗從病貉肺臟、肝臟、心血等組織進行分離培養的多殺性巴氏桿菌進行藥敏試驗，測定其耐藥譜，科學指導用藥。為下一步為預防和控制該病流行提供參考依據。

1　材料與方法

1.1病料來源送檢的病貉，無菌采集病貉肺臟、肝臟、心血等組織進行分離培養。

1.2主要試劑DL-2 000 Marker、2×Taq Marker Mix、樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒，均購自北京康為世紀生物科技有限公司；ID32E腸道菌鑒定試條法國梅里埃（bioMerieuxsa）公司產品；常規的試劑有本實驗室提供。

1.3實驗動物體重20 g左右健康昆明系小鼠8只，購自北京維通利華實驗動物有限公司。

1.4細菌分離純化無菌采取無菌采集病貉肺臟、肝臟、心血等組織，劃線接種于鮮血瓊脂培養基，37℃恒溫培養12～24 h。

1.5細菌形態特征與培養特性無菌挑取上述純化培養菌，再分別“Z”字形劃線接種于鮮血瓊脂培養基和普通瓊脂培養基中，37℃培養18～24 h后，觀察其生長情況。選取優勢生長菌落移接于營養肉湯進行純培養供鑒定用。

1.6細菌生化特性鑒定用ID32E腸道菌鑒定試劑條進行生化試驗，用自動ATB生化儀測定。

1.7多殺性巴氏桿菌KMT基因的PCR擴增與測序按照樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒說明書進行提取基因組DNA，參照文獻[7]多殺性巴氏桿菌的KMT基因序列設計1對引物，P1：5′-TA?AAC-GAACTCGCCACT-3′，P2：5′－TGGGCTTGTC?GG-TAGTCTT-3′，預擴增片段為348 bp，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。以基因組DNA為模板進行PCR反應。PCR擴增反應體系（50 μL）：2×Taq Marker Mix 25 μL，ddH2O 19 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板4.0 μL。反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性50 s，46℃退火50 s，72℃延伸50 s，72℃中延伸10 min，共30個循環。取出5 μL擴增產物于1%瓊脂糖凝膠中，120 V電泳25 min，觀察PCR擴增產物的條帶。將PCR產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定，測序結果與GenB?nak數據庫中登錄基因序列進行同源性比較分析。

1.8致病性試驗將實驗小鼠分為2組，每組4只，每只小鼠0.2 mL（1×109CFU/mL）腹腔注射；同時設生理鹽水陰性對照。觀察發病及死亡情況，分離細菌并鑒定。

1.9藥敏試驗按照美國臨床檢驗標準委員會推薦的標準K-B紙片法進行試驗和結果判斷[8]。

2　結果分析

2.1細菌形態特征與培養特性鮮血瓊脂平板培養，生長良好，可見均勻一致的灰白色、圓形、濕潤，不溶血的露珠樣小菌落，在普通瓊脂上生長貧瘠。涂片染色鏡檢，可見革蘭氏陰性短桿菌，散在或成雙，美藍染色呈典型的兩極濃染球桿菌，呈卵圓形，中央不易著色。

2.2細菌生化特性鑒定采用自動ATB細菌鑒定儀，利用ID32E腸道菌鑒定試劑條進行生化鑒定，分離菌發酵葡萄糖、果糖、d-甘露醇產酸不產氣，不發酵麥芽糖、蔗糖、鼠李糖，精氨酸雙水解酶陰性，鳥氨酸脫羧酶、接觸酶、氧化酶為陽性，吲哚試驗為陽性。鑒定結果為多殺性巴斯德菌，評定結果合格率為99.5%。

2.3多殺性巴氏桿菌KMT基因的PCR擴增與測序用多殺性巴氏桿菌種特異性KMT基因對該菌進行的PCR鑒定，擴增出大約為348 bp的目的條帶，結果見圖1。PCR擴增產物經測序，與Gen?Bank DNA序列數據庫中已發表的多殺性巴氏桿菌Kmt1基因（NO.AF016259）序列同源性為100%，確定該從病貉分離的菌株為多殺性巴氏桿菌。

圖1　多殺性巴氏桿菌特異性KMT基因的PCR擴增結果

2.4致病性試驗試驗組小鼠24 h左右全部發病死亡。分離培養鑒定、PCR檢測，結果顯示所分離菌與注射的病原細菌一致。對照組4只小鼠健康存活，表明該菌有一定致病性。

2.5藥敏試驗藥敏試驗結果顯示，分離菌對頭孢噻呋、氟苯尼考、阿米卡星、氧氟沙星、阿莫西林敏感；對復方新諾明、慶大霉素、卡那霉素、強力霉素等耐藥，結果見表1。

表1　細菌藥敏結果

3　討論

根據《伯杰細菌鑒定手冊》，多殺性巴氏桿菌，染色鏡檢，呈革蘭陰性短桿菌，散在或成雙，美藍染色呈典型的兩極濃染球桿菌，呈卵圓形，中央不易著色。培養特性表明，了鮮血瓊脂平板培養，長勢良好，在普通瓊脂上生長貧瘠。生化試驗鑒定：分離菌發酵葡萄糖、果糖、d-甘露醇產酸不產氣，不發酵麥芽糖、蔗糖、鼠李糖；接觸酶和氧化酶、鳥氨酸脫羧酶為陽性，吲哚試驗為陽性。通過培養特性、形態觀察、生化鑒定，PCR方法檢測特異性KMT基因，測序結果運用BLAST軟件比對，與多殺性巴氏桿菌同源性為100%，確定多殺性巴氏桿菌。通過人工感染小鼠致病性試驗，試驗組小鼠24 h左右全部發病死亡，分離培養鑒定、PCR檢測，結果顯示所分離菌與注射的病原菌一致。對照組小鼠健康存活，證明該菌株具有致病性，是引起該貉肺炎主要病原菌，為臨床治療貉肺炎提供理論依據。

近年來，貉的犬瘟熱、腺病毒等病毒性疾病的不斷發生，細菌病也常常繼發或并發感染[9]，其中多殺性巴氏桿菌病是毛皮動物主要的細菌性疾病之一。為了提高養貉效益，既要做好病毒性疾病的預防，又要對細菌性疾病進行防治。改善衛生環境條件，提高機體抵抗力來抗御病原菌的攻擊。控制該病有效方法是免疫接種和藥物治療，多數養殖場只重視犬瘟熱等病毒病疫苗的預防接種，忽略了該病的免疫，因而造成本病的多發。多殺性巴氏桿菌易產生抗藥性，導致藥物治療效果不明顯。藥敏試驗顯示，14種抗生素中僅對頭孢噻呋、阿米卡星、氟苯尼考等5種藥物敏感；慶大霉素、強力霉素等耐藥。因此當養殖場發生疾病時，根據藥敏試驗結果進行科學用藥，才能獲得良好的治療效果。

[1]房海，史秋梅，陳翠珍，等.人獸共患細菌病[M].北京：中國農業科學技術出版社，2012：422-446.

[2]楊正時，房海.人及動物病原細菌學[M].石家莊：河北科學技術出版社，2003：497-544.

[3]于愛紅，王燕，張開玲，等.多殺巴斯桿菌致手術切口感染1 例[J].中華醫院感染學雜志，2008，18（18）：1143.

[4]史莉，李萍，孫光成，等.多殺巴斯桿菌引起肺部感染1例[J].中華醫院感染學雜志，2007，18（5）：548.

[5]Dugal F，Belanger M，Jacques M.Detection of Respiratory Pathogens in Porcine Lung Tissue and Lavage Fluid[J].Canadian Jouranl of Veterinary Research，1992，56：260-264.

[6]劉曉民，張海豐，王春明，等.貂鏈球菌和巴氏桿菌混合感染的分離與鑒定[J].黑龍江八一農墾大學學報，2006，18（3）：68-70.

[7]黃仆，代洪波，劉孟良.豬肺疫多殺性巴氏桿菌的分離鑒定[J].獸醫導刊，2012，5（87）：56-63.

[8]National Committee for Clinical Laboartory Standards，Perfom?rance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility test for bacteria isolated from anima1s：approved standard[J].sec?onded，NCCLS document M31-A2.Wayne，USA，2000，49（21）：105-126.

[9]錢愛東，李影.毛皮動物疾病（獸醫全攻略）[M].北京：中國農業出版社，2009：183-193，235-252.

S855.1+2文獻標志碼：B

0529-6005（2016）07-0040-02

2015-07-31

河北省科技計劃14826613D；秦皇島市農業科學研究院項目2014-04；秦皇島科技局項目201502A054

張召興（1988-），男，碩士生，研究方向為獸醫微生物學與免疫學，E-mail：keshiyjszzx0224@126.com

李佩國E-mail：lpeiguo@163.com；史秋梅E-mail：shiqiumei@126.com